结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统与生物膜

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病的病原菌。其处于持续生存的休眠状态时,可导致长期无症状感染,称为结核潜伏感染。研究显示,结核分枝杆菌染色体中存在大量 “毒素-抗毒素系统”(toxin-antitoxin system,TAS),某些TAS在潜伏感染中发挥作用,可调节细菌生长和诱导细菌进入休眠状态;某些TAS参与生物膜形成和应激反应,但其影响生物膜形成的机制尚未阐明。生物膜中的结核分枝杆菌对多种抗结核药物耐药,且能抵抗宿主免疫系统防御;休眠状态的结核分枝杆菌对抗结核药物通常也是耐受的,给结核病治疗带来了巨大挑战。本文就近年来结核分枝杆菌TAS与生物膜的研究及抗结核药物对生物膜形成的影响进行综述。     

结核分枝杆菌Ⅱ型毒素-抗毒素系统的研究进展

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,简称TA系统)是广泛存在于自然界微生物中的遗传元件,与细菌应激反应或对抗生素产生耐受有关.结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)在人体中形成潜伏感染可能与细菌形成的特殊休眠状态有关,其可逃避宿主免疫系统的监视和清除;TA系统参...     

结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统 maz EF6缺失突变株的构建及其表型的初步探讨

为构建结核分枝杆菌毒素‐抗毒素系统 m azEF6缺失突变株,并对其表型进行初步探讨,首先用聚合酶链反应（PCR）分别从H37Rv标准株和PUC‐19K质粒扩增出 mazEF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan ;然后应用融合PCR技术将 mazEF6基因的同源臂与 kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,将该融合片段克隆于pMD‐19T（simple）载体形成自杀质粒pMD‐19T‐ΔmazEF6‐kan ,并将自杀质粒转化至大肠埃希菌DH5α中;最后利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中,在卡那霉素抗性改良罗氏培养基上筛选H37Rv ΔmazEF6缺失突变株单个菌落,提取阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段并测序。将所获得的H37Rv ΔmazEF6缺失突变株进行遗传稳定性检测后,对其表型进行初步研究。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变;与野生株相比,缺失株生长速度缓慢且细菌形态短小。本研究证实,融合PCR技术便于快速获得结核分枝杆菌缺失突变株;结核分枝杆菌在缺失毒素‐抗毒素系统 m azEF6基因后生存能力下降,这为进一步研究毒素‐抗毒素系统的作用奠定了基础。     

毒素-抗毒素系统介导持留菌形成机制的研究进展

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统是广泛存在细菌基因组上的由两个基因组成的操纵子,分别编码稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素,其中毒素蛋白具有多种生物学功能。持留菌是指能够耐受高浓度抗生素或不利环境的一类细菌,它们同样具有TA系统。现就毒素-抗毒素系统介导持留菌形成机制的研究进展作一综述。     

假结核耶尔森氏菌中Phd-Doc毒素-抗毒素系统的功能鉴定

【背景】毒素-抗毒素系统在微生物体内广泛存在,在微生物对抗外界不良环境方面发挥重要作用。【目的】以模式细菌假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,Yptb)为材料,探究其编码的Phd-Doc毒素-抗毒素系统的作用机制和生物学功能。【方法】通过生物信息学方法预测Yptb中编码的Phd-Doc毒素-抗毒素系统,通过毒性分析、基因表达分析及蛋白相互作用对其进行鉴定;通过抗生素胁迫、氧胁迫、生物被膜形成等实验研究Phd-Doc在体内发挥的生物学功能。【结果】生物信息学分析鉴定出一对Phd-Doc毒素-抗毒素系统,发现二者共转录且相互作用;毒素蛋白Doc能够引起大肠杆菌形态发生变化并抑制其生长,抗毒素蛋白Phd能中和Doc的毒性;Phd-Doc毒素-抗毒素系统具有自调控抑制效应;phd-doc的缺失对Yptb自身的生长无影响,而且毒素蛋白Doc在野生型Yptb内过表达并未显示毒性;phd-doc在转录水平上响应了抗生素胁迫和氧胁迫,其中,对氯霉素胁迫最为敏感,但并不影响Yptb的生长;同时,Phd-Doc能够影响Yptb的生物被膜形成能力。【结论】Yptb中Phd-Doc毒素-抗毒素系统的功能鉴定对于更好地了解在多变的外部环境下微生物的定殖和响应机制具有重要意义。     

副溶血弧菌染色体上毒素-抗毒素系统YefM-YoeB的鉴定

[背景]副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌,给公众健康带来严重危害.毒素-抗毒素系统广泛存在于细菌和古生菌基因组中,具有重要的生物学功能.[目的]在副溶血弧菌中鉴定新的毒素-抗毒素系统,为从毒素-抗毒素系统角度探讨该菌致病性和耐药性的分子机制奠定基础.[方法]通过在线工具预测副溶血弧菌染色体上的假定Ⅱ型毒素-抗毒素系统...     

细菌II型毒素-抗毒素系统活性的调控

细菌毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA)由稳定的毒素和不稳定的抗毒素构成,几乎存在于所有细菌中。已证明染色体编码的II型TA系统作为胁迫反应因子,通过毒素作用于不同的细胞靶点来调控重要的细胞活动过程,使细菌适应不同的环境胁迫。因此,毒素活性的调控是II型TA系统介导细菌适应性胁迫反应的关键。本文总结了II型TA系统毒素活性调控机制的研究进展,并介绍了作者近年来对模式蓝藻Synechocystis sp.PCC6803中II型TA毒素活性调控的研究结果。     

细菌中Ⅰ型毒素-抗毒素系统的研究进展

毒素-抗毒素系统是广泛存在于细菌和真菌细胞内的一对小型遗传控制元件,毒素基因编码稳定的蛋白质分子,抗毒素基因编码的则是稳定性较差的蛋白质或者是具有调控功能的RNA.人们对于毒素分子在细胞内的生物靶标、分子结构与功能、体内调节机制等进行了大量的研究,不仅揭示了毒素-抗毒素的生理功能,而且为多种生物技术中的应用提供了新的素材.目前发现共有5大类型的毒素-抗毒素系统,其中Ⅰ型毒素-抗毒素系统的抗毒素分子为调节型RNA,可以通过多种不同途径与毒素蛋白质的mRNAs结合从而中和毒素的细胞毒性.Ⅰ型毒素-抗毒素系统以其独特的调节性RNA的调控方式,成为目前毒素-抗毒素研究中的重要热点.本文将对目前Ⅰ型毒素-抗毒素系统的研究进展进行综述,并对其可能的应用前景进行展望.     

原核生物毒素-抗毒素系统的研究进展

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,简称TA系统)广泛存在于原核生物(细菌和古菌)的基因组中,通常TA系统由毒素和抗毒素两部分组成,毒素发挥毒性抑制细菌生长,抗毒素可以解除抑制,它们通过体内的调控作用来对细菌或古菌的生长活动进行调节。研究发现,TA系统根据其性质及抗毒素中和毒素的方式不同可以分为8种类型Ⅰ～Ⅷ,不同类型的TA系统之间又存在着错综复杂的交互作用,而且此系统在细菌中发挥的作用也一直是近年来学者们研究的热点。现就TA系统的最新分类、TA系统的功能以及应用作一概述。     

细菌毒素-抗毒素系统的研究进展

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TA)由两个共表达的基因组成,其中一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白(antitoxin),另一个基因编码稳定的毒素蛋白(toxin).毒素-抗毒素系统最早发现于一些低拷贝的质粒,用来维持低拷贝质粒在菌群中的稳定存在.随后的研究表明,毒素-抗毒素系统广泛存在于细菌,包括一些致病菌的染色体上.在营养缺乏等不良生长条件下,由于基因表达的抑制和蛋白酶的降解作用,不稳定的抗毒素蛋白减少,从而产生游离的毒素蛋白,导致细菌的生长抑制和死亡.毒素-抗毒素系统的生理功能目前还存在争议,有学者认为细茼染色体上的毒素-抗毒素系统可以在不良生长状况下介导细菌的死亡,即细茼程序性细胞死亡(baeterial programmedcell death).但也有证据显示,毒素-抗毒素系统的功能更偏向于应激状态下的生理调节方面,即只起应激状态下的抑菌作用而不是杀菌作用.对细菌生长调控中毒素-抗毒素系统的作用机理进行综述,并探讨毒素-抗毒素系统研究的理论和应用价值.     

结核分枝杆菌信号转导与耐药的研究进展

摘要:结核分枝杆菌感染每年导致200万人口死亡,而化疗已经产生了严重的广泛传播的耐药性。信号转导系统是细菌适应周围环境变化的重要分子机制,是否介导细菌耐药性的产生,尚无清楚的认识。本文主要介绍了结核分枝杆菌的12对二元信号转导系统并分析了其与耐药性产生的关系。通过对近期研究的分析,我们发现MprB/A、PhoR/P、DosR/S/T、SenX3/RegX3、MtrB/A五对二元信号转导系统有可能通过不同的机制使结核分枝杆菌对抗结核药物发生耐药性,因此二元信号转导系统是有效的调控靶位点,有可能应用小分子化合物靶向调节二元信号转导途径以逆转耐药。     

细菌ClpX蛋白酶的结构和功能

ClpX是热休克蛋白Hsp100蛋白家族的成员之一,在生物体中非常保守。Hsp100/Clp分子伴侣家族功能主要涉及到细胞对环境的压力耐受、胞内蛋白质的周转、DNA复制和基因表达等。结核分枝杆菌所导致的结核病仍然是全球人类健康的主要威胁。致病菌中的ClpX蛋白酶在基因的表达调控、致病性以及宿主免疫压力耐受中都具有非常重要的功能。本文总结了ClpX蛋白酶的结构、底物以及所调控的基因;分析了结核分枝杆菌ClpX蛋白酶的进化特征,并探讨了结核分枝杆菌ClpX蛋白酶可能的生理功能和在致病性中的重要作用。     

结核分枝杆菌ABC转运蛋白与物质的跨膜转运

结核分枝杆菌作为一种胞内寄生菌,主要存在于巨噬细胞吞噬体内,并且通过与宿主细胞竞争摄取营养物质、主动排出有毒物质来维持生存。因此,参与上述过程的ABC转运蛋白在结核分枝杆菌的致病中发挥着举足轻重的作用。已有报道结核分枝杆菌基因组编码了38个ABC转运蛋白。这类蛋白质有着广泛的底物结合谱,参与了无机离子、糖类、氨基酸、寡肽、药物等多种物质的跨膜转运。本文将对结核分枝杆菌编码的ABC转运蛋白超家族中的不同成员及其底物特异性、转运机制以及与毒力的关系的研究进展进行综述。     

结核分枝杆菌Rv1168c蛋白的基因表达、纯化及结构分析

【目的】应用原核表达体系对结核分枝杆菌PPE蛋白家族Rv1168c进行高效表达,进一步进行蛋白纯化和结构分析。【方法】以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增Rv1168c基因,构建pET32a-Rv1168c重组质粒;转化重组质粒到大肠杆菌DH5α并在BL21(DE3)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)鉴定Rv1168c在大肠杆菌中的表达情况;Ni-NTAHis﹡Bind Resin纯化重组蛋白Rv1168c;SDS-PAGE和质谱分析测定相对分子量后,用圆二色光谱(CD)和同源模建方法分析和检测重组蛋白Rv1168c的二级和三级结构。【结果】成功克隆了971bp的目的基因Rv1168c,并获得了高纯度的重组蛋白Rv1168c。重组蛋白的分子量为51.5kDa(含载体蛋白)。25℃时重组蛋白Rv1168c的二级结构包括34.4%α螺旋,33.7%β转角,31.9%无规则卷曲,它的三维模型显示为(β/α)5结构。【结论】成功得到高纯度的重组目的Rv1168c蛋白,并初步进行了结构分析,为进一步对Rv1168c结构和功能研究奠定了基础。     

Tuberculosis vaccine design: influence of the completed genome sequence

Tuberculosis continues to be a major health problem, with more adults dying from Mycobacterium tuberculosis than any other pathogen world-wide.With the onset of the HIV epidemic and an increase in drug-resistant M. tuberculosis strains, the need for an improved vaccine has become an international priority.The recent completion of the genome sequences for two M. tuberculosis strains provides a wealth of information that can be used to design new strategies for vaccine development. The challenge comes in making rational choices from among the 4,000 genes of the most probable candidate immunogens or virulence genes.Thus, a well-designed screen is needed to reduce the number of candidates that must be tested. Presently, the most valuable role that bioinformatics can play is to provide such a screen.     

Tuberculosis patients co-infected with Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis in an urban area of Brazil

In this cross-sectional study, mycobacteria specimens from 189 tuberculosis (TB) patients living in an urban area in Brazil were characterised from 2008-2010 using phenotypic and molecular speciation methods (pncA gene and oxyR pseudogene analysis). Of these samples, 174 isolates simultaneously grew on Löwenstein-Jensen (LJ) and Stonebrink (SB)-containing media and presented phenotypic and molecular profiles of Mycobacterium tuberculosis, whereas 12 had molecular profiles of M. tuberculosis based on the DNA analysis of formalin-fixed paraffin wax-embedded tissue samples (paraffin blocks). One patient produced two sputum isolates, the first of which simultaneously grew on LJ and SB media and presented phenotypic and molecular profiles of M. tuberculosis, and the second of which only grew on SB media and presented phenotypic profiles of Mycobacterium bovis. One patient provided a bronchial lavage isolate, which simultaneously grew on LJ and SB media and presented phenotypic and molecular profiles of M. tuberculosis, but had molecular profiles of M. bovis from paraffin block DNA analysis, and one sample had molecular profiles of M. tuberculosis and M. bovis identified from two distinct paraffin blocks. Moreover, we found a low prevalence (1.6%) of M. bovis among these isolates, which suggests that local health service procedures likely underestimate its real frequency and that it deserves more attention from public health officials.     

A host-vector system for molecular study of the intracellular growth of Mycobacterium tuberculosis in phagocytic cells

The mechanisms by which Mycobacterium tuberculosis survives and persists in phagocytic cells remain poorly understood. To study the question, a convenient and safe host-vector system is indispensable. In this study it has been shown that, in contrast with M . smegmatis strain mc²155 which has been widely used for molecular analysis, M. smegmatis strain J15cs is able to survive even at day 6 post-infection in a murine macrophage cell line, J774. The survivability of J15cs was found to depend on the culture medium used for the bacteria prior to infection. Bacteria precultured on nutrient agar medium showed a high survivability and a characteristic cell wall ultrastructure. A plasmid vector, pYT923hyg, was developed from an Escherichia coli - mycobacterium shuttle vector pYT923 (previously constructed in our laboratory) to obtain three drug resistant genes (amp-, hyg- and km-resistant gene) and cloning sites in the km resistant gene. The vector pYT923hyg exerted no influence on in vitro growth of J15cs and intracellular survival in J774 cells, and was stably retained in J15cs after serial subculturing (three subcultures) in Luria-Bertani broth and at day 5 post-infection into J774 cells. Furthermore, using this system, the possibility of a relationship between some seemingly essential genes of M. tuberculosis and intracellular growth was demonstrated.
In this study, M. smegmatis strain J15cs and pYT923hyg were found to be capable of serving as an appropriate host-vector system for molecular study of the intracellular growth of M . tuberculosis in phagocytic cells; this system may be useful as a screening tool for M . tuberculosis genes.     

斑马鱼-海分枝杆菌模型研究对结核病致病机理的启示

全世界约三分之一的人口感染过结核分枝杆菌,其导致的结核病仍然是全球公共卫生的严重威胁。结核菌是典型的胞内致病菌。结核菌的致病性与其成功逃避和利用宿主免疫应答等密切相关。控制结核病需要深入了解致病菌和宿主之间的相互作用。不同的动物模型是揭示致病菌-宿主相互作用的关键。海分枝杆菌-斑马鱼模型是最近才得以发展并获得了不少新见解的研究系统之一。本文总结了该模型揭示的海分枝杆菌毒力因子Erp、Esx-1、pmiA、Mel1和Mel2、KasB等,以及该模型的优缺点。这些结果为大动物模型研究和深入了解结核分枝杆菌感染人体的致病机理提供了线索。     

An NAD+ Phosphorylase Toxin Triggers Mycobacterium tuberculosis Cell Death

1. Download high-res image (218KB)
2. Download full-size image