伪狂犬病病毒Ea株基因组UL区的克隆与序列分析

从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中扩增到3.76 kb的基因组片段,该片段包含UL31、UL32、UL33和UL34基因完整编码区,以及UL30和UL35基因部分序列.UL31、UL32、UL33和UL34基因G+C含量为69.5%~73.4%,偏向于使用富含GC特别是第三密码子位置上核苷酸是C或G的密码子,Ala、Leu、Arg的利用率最高,占氨基酸残基总数的36.4%.PRV Ea株UL31和UL32基因与PRV Ka株核苷酸与氨基酸序列同源性都很高,在98%以上;而UL33和UL34基因与Ka株的氨基酸序列同源性较低,分别为95.7%和94.8%.UL31基因在疱疹病毒α-亚科所有成员之间都很保守,并且UL31基因与马疱疹病毒IV型同源程度最高.UL32、UL33和UL34基因均与牛疱疹病毒I型同源程度最高.UL31、UL32、UL33与UL34基因产物均有酪蛋白激酶2磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,表明UL31、UL32、UL33、UL34蛋白质可能都是磷酸化蛋白质.     

伪狂犬病病毒Ea株基因组UL区的克隆与序列分析

从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中扩增到3．76kb的基因组片段,该片段包含UL31、UL32、UL33和UL34基因完整编码区,以及UL30和UL35基因部分序列。UL31、UL32、UL33和UL34基因G C含量为69．5％～73．4％,偏向于使用富含GC特别是第三密码子位置上核苷酸是C或G的密码子,Ala、Leu、Arg的利用率最高,占氨基酸残基总数的36．4％。PRV Ea株UL31和UL32基因与PRV Ka株核苷酸与氨基酸序列同源性都很高,在98％以上;而UL33和UL34基因与Ka株的氨基酸序列同源性较低,分别为95．7％和94．8％。UL31基因在疱疹病毒α—亚科所有成员之间都很保守,并且UL31基因与马疱疹病毒IV型同源程度最高。UL32、UL33和UL34基因均与牛疱疹病毒I型同源程度最高。UL31、UL32、UL33与UL34基因产物均有酪蛋白激酶2磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,表明UL31、UL32、UL33、UL34蛋白质可能都是磷酸化蛋白质。     

伪狂犬病病毒糖蛋白G基因的结构分析及其原核表达

利用PCR技术扩增了伪狂犬病毒湖北株 (PRVHB)糖蛋白G(gG)基因 ,进行了序列测定和分析。结果显示扩增和测序片段长 180 4bp ,G C含量 6 8.78%。gG基因ORF长 15 0 0bp ,编码 5 0 0个氨基酸组成的多肽。与PRVRice株 gG基因比较 ,两者核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为 98%、84.1%。 32 0～ 380位之间的氨基酸序列存在较大差异。根据序列分析结果 ,选取 gG基因长短不同的两个片段分别克隆到原核表达载体 pET2 8a( )进行表达。经SDS PAGE和Dot ELISA分析证实 ,表达出分子量大小分别约为 5 5kD和 6 3kD的特异性gG多肽 ,这为深入阐明PRV gG基因结构与功能及研制 gG ELISA诊断试剂盒奠定了基础     

伪狂犬病病毒糖蛋白G基因的结构分析及其原核表达

利用PCR技术扩增了伪狂犬病毒湖北株(PRV HB)糖蛋白G(gG)基因,进行了序列测定和分析.结果显示扩增和测序片段长1804bp,G+C含量68.78%.gG基因ORF长1500bp,编码500个氨基酸组成的多肽.与PRV Rice 株gG基因比较,两者核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为98%、84.1%.320～380位之间的氨基酸序列存在较大差异.根据序列分析结果,选取gG基因长短不同的两个片段分别克隆到原核表达载体pET28a(+)进行表达.经SDS-PAGE和Dot-ELISA分析证实,表达出分子量大小分别约为55kD和63kD的特异性gG多肽,这为深入阐明PRV gG基因结构与功能及研制gG-ELISA诊断试剂盒奠定了基础.     

猪戊型肝炎病毒swCH-GS189株ORF2基因的克隆及序列分析

为进行猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因特征研究,参照GenBank中已发表的戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列,设计了一对扩增HEV ORF2基因的引物,利用RT-PCR等方法克隆出了一株猪戊型肝炎病毒甘肃分离株GS189的ORF2基因cDNA片段.序列测定结果表明,swCH-GS189株的ORF2基因长2 025 bp,编码674个氨基酸,与GenBank中公布的其它毒株间的核苷酸序列同源性为79.1%～91.8%,推导的氨基酸序列同源性为89.5%～98.8%.系统发育进化树结果表明,该分离株为基因IV型.     

猪伪狂犬病综合诊断及分离毒株gE和TK基因遗传变异分析

2012年以来,许多使用gE基因缺失活疫苗免疫过的猪场广泛性出现伪狂犬病毒(PRV)感染,gE抗体阳性率不断升高,伪狂犬典型病例不断增加。2018年3月鲁南地区几个种猪场先后发生疑似伪狂犬病疫情,怀孕母猪流产、产死胎和木乃伊胎,仔猪出现神经症状且死亡率高。通过对病死猪及死胚剖检进行初步诊断,取病料进一步进行病理组织学诊断及病毒分离鉴定。结果显示,病死猪均可见病毒性脑炎、肝细胞变性坏死及淋巴组织坏死等病理变化,在病变的神经元、肝细胞、扁桃体隐窝上皮细胞等细胞核内见红染包涵体。对分离到的4株PRV进行了gE和TK基因的序列测定及遗传变异分析发现,4株PRV的gE和TK核苷酸序列的同源性分别为98.8%~99.3%和98.9%~99.6%,与国内流行毒株其核苷酸序列的同源性分别99.1%~99.7%和98.6%~99.8%,与匈牙利和美国等流行毒株核苷酸序列的同源性分别为97.3%~97.8%和98.8%~99.5%,表明4株分离株高度同源,与国内PRV变异株处在同一分支,而与匈牙利和美国等毒株遗传距离较远。传统疫苗对PRV变异毒株不能提供有效保护,给猪场伪狂犬病的防控和净化工作带来了新的挑战。     

鳜鱼CRP cDNA和斜带石斑鱼AAT cDNA的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法分别克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)cDNA全序列和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)cDNA全序列.鳜鱼CRP基因cDNA全长为914 bp,其中5'非翻译区(5'-UTR)为49 bp,3'非翻译区(3'-UTR)为199 bp,开放阅读框(ORF)为666 bp,编码222个氨基酸.序列同源性分析发现,推测的鳜鱼CRP氨基酸序列与小鼠(Mus musculus)、人类(Homo sapiens)、大鼠(Rattus,norvegicus)、非洲蟾蜍(Xenopus tropicalis)和中国鲎(Tachypleus tridentatus)的CRP氨基酸同源性分别为33.2%、32.4%、31.5%、24.9%和22.4%.斜带石斑鱼肝脏ATT基因cDNA全序列长1 785 bp,其中,5'-UTR为13 bp,3'-UTR为530 bp,ORF为1 242 bp,编码414个氨基酸.序列同源性分析发现,推测的斜带石斑鱼AAT氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(X.laevis)、楔齿蜥(Sphenodon punctatus)、大鼠、人类、狒狒(Papio papio)和小鼠的AAT氨基酸序列同源性分别为59.2%、40%、38.6%、38.5%、37.7%、37%和36%.鳜鱼CRP基因和斜带石斑鱼AAT基因cDNA全序列的获得为其疾病相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗仔鱼成活率有重要意义.     

猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计一对PCV-2特异性引物,用该室分离的PCV-2豫A株感染PK-15细胞,从中提取PCV-2复制型基因组DNA,并以之为模板进行PCR扩增.回收PCR产物,构建重组测序质粒T-PCV-2.测序结果表明,猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组为1767bp,与GenBank收录的PCV-2国外分离株核苷酸的同源性可高达97%.序列分析表明,复制型豫A株的基因组包含10个读码框架,其中ORF1、ORF2是其两个最主要的读码框架,分别编码314、234个氨基酸.豫A株和PCV-1间的ORF1、ORF2的氨基酸序列同源性分别为85%、66%,与其它PCV-2毒株间的ORF1氨基酸同源性均在98%以上,而ORF2的氨基酸同源性为92%～97%.     

玉米大斑病抗性基因Ht1定位区域内候选序列的生物信息学分析

为获得玉米大斑病抗性基因Ht1候选序列, 文章采用生物信息学方法对与玉米大斑病抗性基因Ht1紧密连锁的分子标记umc22和umc122定位区域内候选序列进行了分析, 其中得到的63条ORF序列中有14条序列可编码蛋白质结构域。将14条核苷酸酸序列预测出的氨基酸序列与已克隆的24条抗性基因编码氨基酸序列进行Blast比对及进化树构建。结果发现, 候选序列gpm565a具有植物抗性基因编码产物的高度保守结构域, 而且与抗性基因Xal相似性高、亲缘关系近, 推测可能与抗性基因Ht1有关。其他候选序列由于不具有植物抗性基因编码产物的高度保守结构域或者相似性低、亲缘关系远等原因, 不能确定与抗性基因Ht1有关。通过对候选序列gpm565a进行二级结构及三维结构分析, 发现有大量构成蛋白质特异功能结构组件的无规则卷曲存在, 推测gpm565a可能是Ht1功能域的一部分。     

锦鲤疱疹病毒丹东株ORF83基因克隆及生物信息学分析

锦鲤疱疹病毒病是具有高致病性、传染性的疾病,对渔业生产造成巨大的危害。为了研究锦鲤疱疹病毒衣壳蛋白ORF83的结构和功能,本研究采集感染锦鲤疱疹病毒活鱼样品,经DNAStar软件预测分析、DNA提取,PCR扩增、重组质粒构建等步骤成功克隆到ORF83(1)和ORF83(2)基因。应用生物信息学分析蛋白结构与功能,并构建系统进化树。结果显示,两蛋白均能编码前体蛋白,均由α螺旋、β折叠、无规则卷曲组成,均有4个跨膜区域;抗原性较好;但不含保守结构域;ORF83(1)N端11个氨基酸序列为信号肽序列;ORF83(2)N端33个氨基酸序列为信号肽序列;ORF83(1)氨基酸序列存在1个潜在的N-糖基化位点、ORF83(2)氨基酸序列存在3个潜在的N-糖基化位点,两蛋白均潜在13个磷酸化位点,无潜在的O-糖基化位点;系统进化树分析表明,KHV-DD ORF83与美国株、以色列株、日本株均具有同源性。通过研究表明,本研究成功克隆到ORF83基因,并对其结构和功能进行分析,获得重要的生物信息学数据,为进一步研究锦鲤疱疹病毒发病机制和疱疹病毒抗体制备等提供了理论基础。     

A comparison of complete genome sequences of a rabies virus chinese isolate SH06 with the vaccine strains

In this study, we determined the complete nucleotide and deduced amino acid sequence of a primary isolate of rabies virus (SH06) obtained from the brain of a rabid dog. The overall length of the genome was 11 924 nucleotides. Comparison of the genomic sequence showed the homology of SH06 at nucleotide level with full-length genomes of reference vaccine strains ranged from 82.2% with the PV strain to 86.9% with the CTN strain. A full-length genome-based phylogenetic analysis was performed with sequences available from GenBank. Phylogenetic analysis of the complete genome sequences indicated that the SH06 exhibited the highest homology with rabies street virus BD06 and CTN vaccine strain originated from China.     

伪狂犬病病毒鄂A株TK－／gG－／LacZ＋突变株的构建

为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒pSTK1-4,进一步改造成为转移质粒pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化,然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/LacZ^ 突变株基因组DNA共转染PK－15细胞,等完全病变后,收毒作空斑试验,PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化3次,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的无TK^-/LacZ^ 突变株污染的TK缺失的重组病毒,分别以TK缺失株病毒与鄂A野毒株为模板对TK基因进行PCR扩增,扩增产物经酶切分析和测序后发现：TK缺失重组病毒的TK基因缺失了205个碱基,XhoⅠ和SalⅠ位点消失,SmaⅠ酶切片段发生变化,两种病毒在PK－15细胞上形成空斑的大小和增殖 滴度无明显的差别。进一步提取TK缺失突变株基因组DNA,与含gG-LacZ的转移质粒pUSKZ通过磷酸钙法共转染PK－15细胞,待完全病变后,在X-gal存在下筛选蓝斑,将桃取的蓝斑纯化3次后,对纯化的重组病毒进行TK、LacZ扩增,结果既能扩增出较以鄂A野毒株为模板扩增的要小的TK基因片段,同时又能扩增出LacZ基因,证实所得到的重组病毒为TK^-/gG^-/LacZ^ 突变株。此双缺失突变株的构建成功,为在我国最终根除伪狂犬病提供了有用的工具。     

我国西藏小反刍兽疫病毒China／Tib／Gej／07—30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析

首次对我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的核衣壳蛋白(N)基因和基因组启动子(GP)区进行序列测定和分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应从发病山羊病料中扩增出小反刍兽疫病毒N基因片段,用cDNA3′末端快速扩增方法获得基因组启动子区片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统发生树。我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的N基因由1689个核苷酸组成,编码525个氨基酸,与India/Jhansi/03等6个已知N基因全序列的PPRV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.7～97.6和94.9～98.5。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30N蛋白与磷蛋白作用的结构序列之一为495LFRLQAM501保守序列,N蛋白281-289位氨基酸含有一个T细胞表位,为281YPALGLHEF289保守序列。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的GP区由107个核苷酸组成,与Tur-key2000等5株其他PPRV毒株同源性为91.8～98.2。N基因核苷酸序列和相应的氨基酸序列系统进化分析表明小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30与亚洲国家分离株关系最近。     

伪狂犬病病毒鄂A株包膜糖蛋白gD基因的克隆与表达

克隆了伪狂犬病病毒鄂A株编码包膜糖蛋白gD的基因并进行了序列测定 ,与国外报道的Rice株相比 ,其核苷酸序列具有 98%的同源性 ,推导氨基酸序列同源性为 97%。将此基因克隆于具有全期启动子盒的杆状病毒转移载体pSX35A中 ,构建成重组转移质粒pSX35A gD ,与致死缺失型线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV OCC- )基因组DNA一起共转染粉纹夜蛾Hi5细胞 ,经同源重组 ,获得含gD基因的重组病毒AcMNPV OCC+ gD。重组病毒经空斑纯化后感染Hi5细胞进行表达分析 ,细胞裂解物的SDS PAGE及Western Blot ting均显示分子量约 47kD的gD蛋白得到了特异性表达 ,其表达量占细胞总蛋白的 6 2 % ,表达的gD蛋白具有免疫原性。     

Nucleotide sequence of cDNA encoding the mitochondrial precursor protein of the ATPase inhibitor from the giant panda (Ailuropoda melanoleuca)

Mitochondrial ATP synthase (F1Fo-ATPase) is regulated by an intrinsic ATPase inhibitor protein. In the present study, using RT-PCR combined with in silico cloning, we isolated and sequenced the cDNA encoding the inhibitor protein of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca). The deduced protein sequence showed that the protein is composed of 106 amino acids and the estimated molecular weight of the ATPIF(1) protein is 12.32 kDa with an isoelectric point (pI) of 10.17. Alignment analysis revealed that the deduced protein sequence shares 66%, 78.3%, 66%, 72.6%, 77.4%, and 78.3% homology with that of Mus musculus, Pan troglodytes, Rattus norvegicus, Bos taurus, Macaca mulatta, and Homo sapiens, respectively. Topology prediction showed that there are three protein kinase C phosphorylation sites, one amidation site, three N-myristoylation sites, one casein kinase II phosphorylation site, and one tyrosine kinase phosphorylation site in the ATPase inhibitor. In particular, amino acids in the region between 39 and 72, which is the minimum sequence showing ATPase inhibitory activity, were highly conserved in the protein.     

人SBK1 cDNA的克隆及其相互作用蛋白的筛选

首次克隆到人的SBK1（homo sapiens SH3-binding domain kinase 1,SBK1）的cDNA序列,并通过生物信息学的手段,电子克隆到人SBK1的基因组DNA序列.人的SBK1是鼠SBK1的直系同源物,两者基因组DNA结构相似,均含有4个外显子.人的sbk1基因ORF长1 275 bp,编码424个氨基酸,而鼠的ORF长1 254 bp,编码417个氨基酸.两者编码区的核苷酸序列同源性达87.7%,而氨基酸序列同源性达95.7%,在羧基端均有一个PV富集区,推测其能与含有SH3结构域的蛋白质结合.将RT－PCR所获得的长度为1 610 bp的sbk1cDNA序列搜索EST数据库,进行电子延伸,最终获得了约5 kb的人sbk1全长mRNA序列,它与鼠的sbk1全长mRNA大小一致;通过比较基因组学发现UniGene族Hs.97837实际上代表了sbk1基因UniGene族Hs.460471的3′UTR区域,而不是代表了一个新的UniGene族.采用酵母双杂交技术,以SBK1为“诱饵”,获得了与之相互结合的蛋白表皮生长因子受体EGFR和核孤儿受体蛋白NR4A1,它们之间的具体功能关系有待进一步研究.     

Characterization of the conserved region of the mxaF gene that encodes the large subunit of methanol dehydrogenase from a marine methylotrophic bacterium

The highly conserved region of the mxaF gene that encodes the large subunit of methanol dehydrogenase (MDH) was cloned and sequenced from Methylophaga sp. strain MP cells. The calculated G + C content of the conserved region was found to be 44.9%. The nucleotide sequence homology of the region to those from methylotrophs was approximately 43.5%, while the identity of the deduced amino acid sequence to other MxaF peptides was approximately 76.8%. Analysis of the codon usage revealed that UUC and CGU codons seem to be used only for phenylalanine and arginine, respectively. The aligned amino acid sequences show that several key amino acids that are required for the MDH enzyme activity are located in the deduced MxaF peptide, together with tryptophan-docking motifs, called W4 and W5.