用抗独特型单抗体外诱发抗天花粉蛋白的二次抗体应答

在前阶段工作中已获得16个抗天花粉蛋白的单抗。用其中的一个IgE类单抗TE 1免疫Wistar大鼠,通过大鼠-小鼠杂交瘤技术得到了抗独特型单抗。现研究抗独特型单抗AId 6c5在体外诱发二次抗体应答中所起的作用。实验结果表明:1.当将AId 6c5和天花粉蛋白初次免疫8周后的小鼠脾细胞和肠系膜淋巴结细胞一起培养时,能引起二次抗体应答,说明AId 6c5能代替抗原的刺激作用,如果培养系统中同时存在AId 6c5和天花粉蛋白(其剂量能引起体外二次抗体应答),则可出现某种程度的抑制。由于AId 6c5是单克隆抗体,提示一种AId能在不同情况下起刺激或抑制作用。3.应用竞争结合试验阐明AId 6c5除和TE 1外,还和另外两个单抗——TE 4(IgE)和2 A1(IgG1)——起反应,先前的工作证明这三个单抗和另外4个单抗都识别天花粉蛋白上的同一抗原决定簇。但AId 6c5对识别这同一决定簇的其余4个单抗反应很弱。以上说明a.IgE和其它Ig类别具有共同或交叉的独特型,b.也说明识别同一决定簇的IgE具有不同的独特型。4.将TE 1等三个单抗和AId 6c5预先作用后能抑制这三个单抗和天花粉蛋白的结合,说明AId 6c5所识别的独特型,位于抗原结合部位内,至少??是很靠近抗原结合部位的。     

小鼠抗天花粉蛋白IgE单克隆抗体的制备、分离和鉴定(英文)

天花粉蛋白是中药天花粉的有效引产成份,在应用中它偶尔也引起过敏反应。我们用杂交瘤技术建立了一株分泌抗天花粉蛋白特异性IgE单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在实验中,二次免疫的C57 BL/6 J小鼠的肠系膜淋巴结细胞和脾细胞分别被用来同NSI骨髓瘤细胞进行融合。虽然在融合前动物血清IgE抗体效价仅为40～160 PCA滴度,但用肠系膜淋巴结细胞进行的4次融合都产生了IgE杂交瘤。阳性率为1.0-6.7%。对比之下,用脾细胞进行的另外两次融合却没有观察到IgE杂交瘤产生,统计结果说明差异显著(P<0.05)。该IgE单克隆抗体可以在体内和体外诱发大鼠肥大细胞脱颗粒。56℃热处理2小时能使该抗体诱导PCA反应的能力完全丧失,然而却不影响其结合抗原的能力。对该单克隆抗体的特异性的鉴定表明,它可以特异性地识别精制天花粉蛋白和结晶天花粉蛋白上的抗原决定簇。     

小鼠的自身反应性T淋巴细胞系及其功能

本文报道了用同基因脾细胞和抗原在体外不断再刺激天花粉蛋白免疫过的C57BL/6J小鼠的T淋巴细胞,能刺激自身反应性的T细胞在体外增殖并长期存活。实验结果表明它们的增殖是依赖于同基因脾细胞的再刺激,C57BL/6J(H一2~b),B 10 ScSn(H-2~b)和129(H-2~b)小鼠的脾细胞都能引起它们明显的增殖,但对C3H/He(H-2~K)和Balb/c(H-2~b)小鼠的脾细胞很弱,说明识别的可能是H-2~b抗原。应用未经免疫的C 57 BL/6 J小鼠的脾和淋巴结T淋巴细胞,采用同样的体外刺激方法,未能引起它们对同基因脾细胞的增殖。从而提示自身反应性T细胞是存在于正常机体内的一种能识别自身抗原的T淋巴细胞。在无外来抗原刺激时,它们可能是处于静止或不激活状态;在外来抗原诱发免疫过程中,它们也随了抗原特异的淋巴细胞一同被激活,并可能起调节作用。它们在免疫系统中的地位还有待进一步阐明。     

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠抗天花粉蛋白的IgE类抗体的研究

检测小鼠IgE类抗体的经典方法是被动皮肤过敏试验(PCA),这是一种生物测定,因而在应用上受到一定限制,并且也受动物本身变化的影响。1973年Hoffman首次报道了用ELISA检测血清IgE。此后有不少工作者相继报道了应用ELISA检测IgE或抗原特异的IgE类抗体。为研究对天花粉蛋白的免疫     

重组CHO细胞乙肝表面抗原诱导小鼠细胞免疫应答的研究

为了研究重组CHO细胞乙肝表面抗原(CHO-rHBsAg)在小鼠中诱导T细胞免疫应答的能力,全面评价疫苗的免疫原性,以CHO-rHBsAg免疫BALB/c小鼠,常规制备小鼠脾脏淋巴细胞并在体外以抗原或特异多肽刺激;采用ELISA法测定抗原特异性T淋巴细胞分泌的细胞因子,乳酸脱氢酶法(LDH)测定抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性,酶联斑点法(ELISPOT)测定CTL频数(CTLp),应用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚群。结果显示,rHBsAg可在小鼠中诱导Th1及Th2类细胞因子;加铝佐剂的rHBsAg较未加佐剂的抗原可诱导较高水平的IFN-γ、CTL克隆及较高百分比的CD8+T淋巴细胞亚群。重组CHO细胞来源的HBsAg可在BALB/c小鼠中诱导一定程度的细胞免疫应答。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV—Ⅰ)体外抗体应答及IFNr的调节

以纯化、灭活的HSV-I为抗原,体外致敏洗涤过的健康成人外周血淋巴细胞,37℃孵育12天,细胞培养上清中的特异性抗体用ELISA法测定。11例血清HSV-I抗体阳性成人的淋巴细胞接受灭活HSV-I抗原致敏后,培养上清中均能检出特异性抗体,抗体类型为IgG(26.6土23ng/m1),体外产生的特异抗体水平与原血清抗体水平无相关性(R=0.45,P>0.05)。同法刺激新生儿淋巴细胞;不能诱生任何类型的HSV-I抗体。在本实验系统中,特异性抗体应答是一个蛋白质的全新(de novo)合成过程,应答水平和体外致敏用的病毒抗原量有明显剂量依赖关系,最适刺激抗原量为108ng/ml。HSV-I抗体应答需要T、B细胞的相互作用,两类细胞单独均不能诱导特异性HSV-I抗体应答。在本实验系统中加入适量重组人γ干扰素,能增强抗体应答水平,过高剂量起抑制作用。     

肿瘤细胞混合肽诱导特异性抗肿瘤免疫应答

采用细胞冻融、加热沉淀及酸处理等基本生化技术, 从肿瘤细胞中获取混合 肽; 将热休克蛋白70与肽体外结合, 观察热休克蛋白70-肽复合物对小鼠脾淋巴细胞的激活增殖作用以及增殖的淋巴细胞对瘤细胞的特异性杀伤作用, 并运用流式细胞仪分析增殖的淋巴细胞类型; 分别通过对腹腔和腿部肌肉接种了H22肝癌细胞的BALB/c小鼠进行热休克蛋白70-H22抗原肽复合物免疫注射, 观察小鼠肿瘤的抑制和荷瘤小鼠的生存期情况. 另外, 对免疫的小鼠采血进行肝、肾功能检测. 结果显示, 获取的混合肽中含有肿瘤特异的抗原肽, 其经热休克蛋白提呈后, 体外可刺激淋巴细胞活化增殖, 增殖的淋巴细胞为T淋巴细胞, 对肿瘤细胞有特异性细胞毒效应, 体内对腹水型和实体瘤型肿瘤的生长均可产生显著抑制作用, 同时延长荷瘤小鼠的生存期, 并且这种体内免疫对小鼠肝肾功能不产生影响, 不会引发自身免疫反应.     

乳杆菌对牛乳β-乳球蛋白致敏小鼠淋巴细胞分泌Th1/Th2型细胞因子和抗体的体外影响

为了分析乳杆菌对致敏小鼠脾淋巴细胞分泌Th1/Th2细胞因子及抗体的体外影响,用牛乳β-乳球蛋白腹腔注射BALB/c小鼠建立过敏症模型,造模成功后,分离致敏小鼠的脾淋巴细胞并与4种活/死乳杆菌(107 CFU/mL)体外共同孵育,ELISA法检测细胞上清液中细胞因子(IL-12、IFN-γ和IL-4)和抗体(总IgE、β-Lg特异性IgE和总IgG)含量。4种活/死乳杆菌均可体外调节致敏小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子和抗体的水平,特别是热致死的发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌可提高淋巴细胞IL-12和IFN-γ的分泌,抑制IL-4的分泌,使其IFN-γ/IL-4比值(代表Th1/Th2细胞平衡)高于活菌,与空白对照组比较差异显著(P<0.05)。同时,这两株热致死菌还可显著下调细胞上清液中总IgE、特异性IgE和总IgG抗体的浓度(P<0.05)。试验结果表明乳杆菌可提高牛乳β-乳球蛋白致敏小鼠脾淋巴细胞的IFN-γ/IL-4比值,进而纠正Th2占优势的Th1/Th2失衡,下调抗体分泌量,且具有菌株特异性。     

抗天花粉蛋白IgE单抗的抗独特型抗体及其鉴定

为了研究抗独特型抗体对天花粉蛋白特异的IgE反应的调节作用,建立了分泌针对天花粉蛋白的IgE单抗的独特型决定簇的大鼠-小鼠异种杂交瘤细胞株(6 C_5)。以分泌抗天花粉蛋白IgE单抗的小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株(TE—1)诱生的腹水,通过免疫亲和层析,分离得到TE-1单抗免疫Wistar大鼠。将免疫大鼠脾细胞与小鼠骨髓细胞(NS-1)进行异种间细胞融合,通过严格的筛选和克隆化,最终得到3侏生长稳定、连续分泌抗体的异种杂交瘤细胞株(6 C_5、3 E_3和8 G_6),并能顺利地经受冰冻保种和复苏。用间接ELISA法对所获得的单抗进行鉴定,即比较三个单抗对下列包被抗原的反应性,其中包括TE-1(天花粉蛋白特异的IgE单抗)、3A 12(天花粉蛋白特异的IgA单抗)、ADNP和142(抗DNP IgE单抗,来自两个不同的杂交瘤株),以及M Ig(正常小鼠血清Ig)。结果表明6C_5单抗只与TE-1呈阳性反应,对其余各种包被抗原的反应均呈阴性,说明杂交瘤株6C_5具有抗TE-1单抗独特型决定簇的特异性,实验经多次重复,因此可以结论,成功地建立了一株能分泌抗独特型抗体的异种淋巴细胞杂交瘤株。此外,8G_6与所有包被抗原均呈强阳性,说明它具有抗各类小鼠Ig共同决定簇的特异性。3 E_3的特异性尚未最终确定。在方法学上的改进包括细胞融合时所用的HAT选择培液中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的剂量较常量加倍,而氨基喋呤的剂量较常量减半。并且缩短在HAT培液中和HT培液中培养时间。这些可能为杂种淋巴细胞杂交瘤株的建立提供了有利条件。为了保证ELISA检测的特异性,作包被抗原的TE-1单抗与免疫大鼠用的TE-1单抗的来源不同,它来自无血清培养液培养的TE-1的上清液。同时,间接ELISA法所采用的酶联第二抗体(兔抗大鼠Ig),通过小鼠Ig的吸收等,证明其与小鼠Ig无交叉反应后才使用。     

应用体内外实验筛选可降低牛乳β-乳球蛋白过敏的乳杆菌

【目的】通过体内外实验评估5种乳杆菌缓解牛乳β-乳球蛋白(BLG)过敏的作用,为今后筛选具有抗过敏活性的乳杆菌提供参考。【方法】首先体外分析5种活的/热致死的乳杆菌促进小鼠原代淋巴细胞分泌细胞因子(CK)IFN-γ和IL-4的水平,随后应用小鼠BLG过敏模型评估这5种乳杆菌抑制过敏的能力。将实验动物随机分为空白组、BLG致敏组和5种活的/热致死乳杆菌组。采用ELISA法检测各组小鼠淋巴细胞分泌Thl/Th2型CK的水平,并测定小鼠血清中总IgE和BLG特异性IgE的含量。【结果】在体外可促进淋巴细胞分泌IFN-γ、抑制IL-4,使其IFN-γ/IL-4比值(代表Thl/Th2细胞平衡)显著高于正常对照组(P<0.05)的乳杆菌,在体内实验中也能有效提高致敏小鼠淋巴细胞的IFN-γ/IL-4分泌率,并显著降低致敏小鼠血清中总IgE和BLG特异性IgE的水平(P<0.05)。相反,在体外的IFN-γ/IL-4比值较低的乳杆菌,不能缓解特异性IgE抗体介导的食物过敏反应。【结论】基于乳杆菌体外刺激小鼠原代淋巴细胞分泌Th1/Th2型CK的结果,可以预测菌株在体内具有可通过纠正Th2占优势的Th1/Th2细胞失衡,下调抗体分泌量,缓解小鼠BLG过敏症状的能力。     

昆明小鼠精子冷冻的研究(简报)

胚胎工程技术是动物品种、品系培育,种质资源保存及转基因动物制备、保种的重要手段。配子的冷冻保存技术目前广泛应用于胚胎工程。和胚胎冷冻相比小鼠精子冷冻技术方便、高效尤其适用于转基因及突变系小鼠的保种。成功的精子冷冻要求复苏后通过体外受精(IVF)获得胚胎,再移植入受体,生长发育并产出幼仔。胚胎体外培养获得足够的晚桑葚胚和早期囊胚是胚胎干细胞建立与制备嵌合体小鼠的成功关键,暂时不用的胚胎应仍能耐受冷冻保存,待复苏移植,建立新的繁殖群。但小鼠精子冷冻研究在我国开展的十分有限,缺乏相关资料数据。本实验对不同周龄SPF级昆明(KM)小鼠进行精子冷冻及冻融精子IVF,并将IVF获得的2-细胞胚胎分别进行胚胎移植、体外培养、胚胎冷冻及复苏后移植,应用冻融小鼠精子进行胚胎工程实践。     

猪卵母细胞体外成熟与冷冻附睾精子的体外受精

由屠宰母猪卵巢分离得到505枚卵母细胞,经成熟培养,其中468枚卵丘细胞扩张,成熟率为92.7％。采用冷冻的附睾精子授精,受精率为41.9％(57/136),其中单精受精率36.8％(50/136),多精受精率5.1％(7/136)。授精卵体外培养24和48小时后的卵裂率分别为5.3％(15/258)和12.9％(30/232)。把35枚早卵裂期胚胎和250枚未见卵裂的1-细胞期受精卵移入4头受体母猪的输卵管内,其中2头妊娠,分别于1990年4月10日和29日正常分娩,共生产仔猪21头。     

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配,共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中,有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。     

家兔胚泡ICM在体外培养系统中的行为

一、用显微外科方法从兔早期胚泡分离来的ICM在所用的体外培养系统中的行为,因ICM的生长状态而不同。呈带状生长的ICM从近端向远处延伸,而细胞的分化则从远端逐渐向近端进行,它具有明显的极性。细胞的分化秩序井然,层次分明。因此呈带状生长的ICM适用于进行细胞分化和细胞谱系的研究。二、呈团块状生长的ICM,没有明显的极性,细胞分化开始于团块的外表面,逐渐向中央进行。细胞分化开始稍晚一些,速度也较慢,这种生长状态的ICM适用于分离胚胎干细胞。三、兔子胚外内胚层从ICM分化来,它经历了二次分化的过程。第一次发生于培养后第三天(相当于交配后第七天),形成第一胚外内胚层-胚外体壁内胚层,它向远处迁移,远离原始外胚层。培养后四天(相当于交配后第八天),形成第二种胚外内胚层-胚外脏壁内胚层,它尾随体壁内胚层向远处迁移,其后缘的部分细胞向原始外胚层附近的滋胚层下面侵润。四、胚外体壁内胚层和脏壁内胚层的细胞是由少数决定了的和离开ICM的细胞分化和增殖而来。五、文中讨论了早期胚胎细胞分化的谱系问题。     

人体肝癌细胞系(SMMC-7721)的糖皮质激素受体以及糖皮质激素对酪氨酸转氨酶的诱导

本文以[~3H]Dex为配体,采用完整细胞GCR和核特异结合百分率的测定方法检测了人体肝癌细胞系(SMMC-7721)的GCR。实验表明,该细胞具有高亲和力、低容量、能与GC进行特异结合的Dex结合部位,该结合部位与[~3H]Dex结合后可向核内转位,因而具备了作为GCR的基本条件。但该细胞的GCR与正常细胞的GCR相比较亦有些差别,GC与受体结合后不能诱导TAT的生成。本文对上述改变的可能机理进行了讨论。     

中国木薯栽培种通过器官发生再生植株研究

本文研究了中国木薯栽培种四种外植体通过器官发生再生植株的条件。结果表明:在MS附加0.05mg/L TIBA,1mg/L BA的培养基上“NZ 188”初步的萌发胚状体“切头”后切口处可直接产生丛芽,出芽率为43%。“SC201”胚状体子叶块在MS附加0.5 mg/L NAA,0.5mg/L BA的培养基上可直接出芽,出芽率为42%,在MS附加0.5mg/L IBA,1.5mg/L BA培养基上·出芽率为31%,AgNO_3和ABA单独使用或配合使用均不利于芽的再生。“NZ188”胚状体下胚轴在MS附加0.5mg/LNAA,0.5mg/L BA的培养基上形成的愈伤组织转入MS附加1mg/L NAA,2mg/L BA的培养基上,3周后大多数愈伤组织有绿点出现、仅4.4%外植体分化出芽。“HZ188”无菌苗茎段接种在MS附加0.05mg/L TIBA,2mg/LBA的固体培养基上,2周后形成大量愈伤组织,4周后仅见一块愈伤组织分化出芽。     

大鼠前列腺上皮细胞角蛋白8mRNA表达调节的定位研究

本文应用反义RNA探针原位杂交法,研究雄激素对大鼠腹侧前列腺(VP)上皮细胞角蛋白(CK)8 mRNA表达的影响。发现1.在任何VP组织切片中,CK 8探针专一、大量定位于VP腺上皮细胞中,CK 8 mRNA是前列腺上皮细胞特异而灵敏的标志。2.去睾大鼠VP CK 8 mRNA染色增强,提示CK 8mRNA有过度表达,注射雄激素又可抑制其过度表达。3.与已知受雄激素抑制性基因不同,即使大鼠VP完全萎缩之后达2个月之久,其存留腺上皮细胞CK 8 mRNA表达仍持续增高。4.前列腺发育早期,迅速增殖的幼稚腺上皮细胞高度表达CK 8 mRNA,以后随着体内雄激素水平升高,VP上皮CK 8 mRNA表达下降,分布转移。以上结果进一步支持前列腺CK 8基因是新的一类受雄激素抑制性基因的推测,同时表明前列腺CK 8基因的表达与前列腺干细胞的增殖分化有密切联系,CK 8 mRNA高度表达是前列腺干细胞一个重要特征。     

进化上保守的小鼠FLANa基因的计算机克隆

EST(expressed sequence tag,表达序列标签)是对cDNA克隆进行测序时得到的序列,一般位于该克隆的一端,序列为单次测序所得到的。现在EST已成为一个非常大的数据库,并被广泛运用于基因家族新成员的寻找,也可作为人染色体上的标志来寻找多态性位点,还可以用来比较某基因在不同组织和病理状态中的表达模式。在EST数据库中,     

狗外周血造血干细胞体外培养条件的探讨

近年来,利用骨髓细胞、胎肝细胞、外周血单个核细胞治疗造血障碍性疾病是引人注目的研究动向,也是治疗极重度放射病包括肠型放射病的可能有效措施。它们有效成分是造血干细胞。就造血干细胞的来源来看,在外周血中的造血干细胞数量虽少,但分离浓集比较方便,也容易为人们所接受。关于外周血干细胞的测试技术,对各种动物都已有报道,但对狗     

爪蟾胚胎原肠中期背方中胚层的组织分化

原肠中期内卷的背方中胚层出现了分别控制脊索和肌肉发育的专一分子的区域化表达。为了研究这个时期的背方中胚层是否已经能够在脱离体内信号的情况下向预定命运分化,我们进行了预定脊索和预定肌肉组织的体外培养,以及两者的共培养,并检测了细胞表达组织专一性分子的情况。原肠中期的预定脊索区域和预定体节区域都能在体外分化成相应的组织——空泡化的脊索和肌细胞,但脊索只能微弱表达其功能分子Shh,肌细胞不能形成肌节。预定脊索区域和预定肌肉区域的共培养也无法增强脊索表达Shh和促进肌细胞形成肌节。我们的结论是,原肠中期内卷的中胚层细胞已经具有了朝预定命运独立分化的能力,但进一步形成功能和结构都完整的相应组织可能还需要周围组织的作用。