类产碱假单胞菌耐热碱性脂肪酶的研究

从福建省福州市温泉澡堂污水浸润土壤中分离筛选到一株耐热碱性脂肪酶产生菌——类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)F331。产酶最适条件为:碳源小麦粉,氮源豆饼粉,起始培养pH9.4～9.5,培养温度24～26℃,培养周期32～34h。经硫酸铵盐析、Sepharose 4B和Sephadex G-200柱层析得到纯化的酶组分。该酶最适作用温度50℃,最适作用pH 10.0,60℃保温80min酶活基本不损失,在pH 7.0～10.0范围内酶蛋白稳定:Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶有激活作用,Pb~(2+).Zn~(2+)、Fe~(2+)和Co~(2+)对酶活有抑制作用。该酶分子量45700。     

产碱假单胞菌脂肪酶的克隆表达及酶学性质研究

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。     

嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在类产碱假单胞菌中的转移与表达

类产碱假单胞菌 (Pseudomonaspseudoalcaligenes)是从盐城市农村粪池中采集的自然病死蝇蛆体内分离的具有显著杀蛆作用的细菌 ,野外使用易受阳光中紫外线的影响而失活。黑色素具有很强的抗辐射作用。将构建的含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的质粒pWSY导入类产碱假单胞菌体内 ,使后者获得了稳定产生黑色素的能力。Southern杂交实验证实酪氨酸酶基因来源于嗜麦芽假单胞菌。SDS PAGE电泳显示该重组子体内额外表达了一分子量约为 1 8kD的蛋白 ,该蛋白很可能就是重组子表达的酪氨酸酶。经测定 ,重组子抗辐射作用明显增强 ,有效杀蛆时间显著延长 ,对畜、禽安全     

类产碱假单胞菌酪氨酸酶基因重组子所产黑色素性质的研究

将构建的含有嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因的重组质粒导入从自然病死蝇蛆体内分离的具有显著杀蛆作用的类产碱假单胞菌体内 ,使后者获得了稳定产生黑色素的能力 ,具有很强的抗辐射作用。所产黑色素是无定形物质 ,在大多数有机和无机溶剂中溶解度低或不溶解 ,在碱性溶液中有较好的溶解性 ,在中性及弱酸性溶液中溶解度低 ,在pH <4的溶液中沉淀 ;可用过氧化氢或次氯酸钠氧化 ,也能被银离子或硫化氢还原 ;含有自由基 ,并能清除由紫外线诱导产生的自由基 ;能吸收所有波长的光线 ,在紫外波长下吸收值最大 ,能有效地保护紫外辐射对蛋白质及DNA等生物大分子物质的损害。     

类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶的纯化和性质

谷氨酸脱氢酶（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＧＤＨ）可逆催化谷氨酸脱氨生成α酮戊二酸和氨,是一种依赖ＮＡＤ（Ｐ）的脱氢酶。其分子形式主要为六聚体或四聚体,大多数ＧＤＨ为六聚体［１］。该酶广泛存在于原核生物和真核生物,在氮、碳代谢的联系方面发挥重要作用。至今已有很多细菌ＧＤＨ得到详细研究［２～４］,但未见类产碱假单胞菌ＧＤＨ的研究报道。本文通过研究类产碱假单胞菌ＧＤＨ的纯化和性质,为揭示该菌的氮、碳代谢机制奠定基础。１　材料和方法１－１　细菌培养液体培养基为含柠檬酸和氯化铵的微量…     

类产碱假单胞菌杀虫蛋白的激光拉曼光谱研究

类产碱假单胞菌是一种新发现的昆虫病原微生物,其代谢产生的杀虫蛋白对蝗虫具有较强的毒杀作用,经由杀虫蛋白的水和重水溶液的拉曼光谱,按照Lippert的方法计算它的二级结构含量,β折叠含量为58%,无规卷曲为34%,侧链C—C—S—S—C—C构型为反式-扭曲-反式.它的酪氨酸残基大部分暴露在分子表面,小部分埋藏在疏水环境中.并讨论了杀虫蛋白结构有可能导致的杀虫机理.     

类产碱假单胞菌杀虫蛋白对蝗虫能量代谢的影响

电镜直接观察结果显示,在类产碱假单胞菌杀虫蛋白作用下,蝗虫中肠细胞线粒体病变严重,多数呈现膨胀,有嵴断裂等现象。氧电极技术分析发现病变后蝗虫胃、肠细胞线粒体氧化磷酸化作用减弱,ATP产生减少,能量代谢被抑制,但ATPase活力基本不受影响,即蝗虫体内能量需求仍可维持正常水平,由此导致蝗虫体内能量供应不足而死亡。     

假单胞菌产脂肪酶条件的初步探索

对假单胞菌（Pseudomonassp）2106菌株产脂肪酶条件的初步探索表明,该菌株脂肪酶为组成型,不受油脂类底物的诱导。碳源的种类（单糖、双糖、多糖）和浓度对产酶影响不大,氮源以豆饼粉和玉米浆混合添加最好。最适发酵温度为32℃,摇瓶转速140r／min。实验中还通过正交试验优化了产酶培养基组成。     

嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

用pUCl8质粒作为载体,将嗜麦芽假单胞菌(Psedeomonas maltophilia P27)的碱性蛋白酶基因克隆到大肠杆菌(E．Coli TGI)中,得到3株能分泌碱性蛋白酶的阳性克隆G1,G2和G3。其中G3所分泌的碱性蛋白酶活性最高,大约是出发菌株的3—4倍,对3株阳性克隆所含的重组质粒psJl,psJ2和psJ3进行限制酶酶切分析表明,酶活最高的阳性克隆G3所含的重组质粒psJ3的插入片段最小,大约是2．8kb;其它两株的重组质粒pSJl和pSJ2含有同样大小的插入片段,约为5．5kb。     

假单胞菌脂肪酶的研究进展

脂肪酶是一种重要的工业用酶,来自于假单胞菌的脂肪酶较来自其它菌株的具有更强的温度、有机溶剂耐受性等比较优势,在有机合成、食品工业、药物制造、油脂深加工等工业应用方面应用潜力巨大。对假单胞菌脂肪酶的分类及性质、结构、表达调控和分泌机制等进行了简要的概述。     

Pseudomonas pseudoalcaligenes B50铁载体合成相关基因pyrD的克隆与功能分析

从棉花根际分离的一株细菌B50在低铁条件下可以产生铁载体。通过形态学特征、生理生化特征及其16SrDNA序列分析,将其鉴定为Pseudomonas pseudoalcaligenes。采用三亲本杂交的方法将转座子Tn5-1063a(含luxAB)导入B50中,进行转座子插入诱变,获得突变株。用TAIL-PCR方法得到与铁吸收有关的pyrD基因序列。通过互补实验验证pyrD与铁载体的合成有关。Pseudomonas pseudoalcaligenes能够产生铁载体属于首次报道。     

一株蝗虫病原菌的分离和鉴定

从内地黄脊竹蝗自然病死虫尸内分离到一种病原菌,其纯培养物经KOCK病症律证明,并按《伯杰细菌鉴定手册》(第九版)的方法进行了生物学测定、生理生化实验,并测定了其DNA中G+Cmol含量为63.73％,确定该病原物为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)。经生物测定,该菌对草地蝗虫和黄脊竹蝗有较强的感染力,对草地其他害虫也有一定的感染力。     

类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶的提纯、鉴定及某些特性的初步研究

从类产碱假单胞菌纯化出电泳纯的谷氨酸脱氢酶,用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为２９０ ｋＤ,亚基分子量为４７ ｋＤ,提示该酶为六聚体．该酶对ＮＡＤＰ（Ｈ）和底物均具有高度专一性,对谷氨酸、α－酮戊二酸及ＮＡＤＰ＋ 的Ｋｍ 值分别为：２８ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ、１．２ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ及０．０６３ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ．用Ｈｉｌｌ作图法求得酶对ＮＨ＋４ 和ＮＡＤＰＨ 的［Ｓ］０．５分别为２４ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ和０．０３７ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ．最适反应温度为５０℃,催化氨化反应和脱氨反应的最适ｐＨ 分别为８．０和８．８,在热稳定性方面不及嗜热细菌的谷氨酸脱氢酶稳定．提纯的谷氨酸脱氢酶在低温（４℃）条件下,可在Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中贮存半年以上,活力无明显下降,冷冻则可导致纯酶液迅速失活．氮源对菌体谷氨酸脱氢酶水平有显著影响．     

An alkalophilic thermostable lipase produced by a new isolate of Bacillus alcalophilus

An extremophilic bacterium, isolated from mangrove detritus, produced an extracellular alkaline-thermostable lipase. The bacterium was identified on the basis of cell morphology, growth characteristics, G+C molar ratio and DNA/DNA hybridization as a strain of Bacillus alcalophilus. The bacterium grew optimally at pH 10.6, 60°C with NaCl tolerance up to 7.5% (w/v). Carbonates and/or bicarbonates enhanced lipase production, while NaCl had an inhibitory effect. Maximum lipase activity was at 60°C at pH 10.6, with approx. 60% of its activity being retained at 80°C after 20min and 80% of its activity was retained at pH 11 after incubation at 60°C. A partially purified lipase had similar stabilities to the crude enzyme.     

一株杀蛆细菌的分离与鉴定

蝇属昆虫纲,双翅目,能传播霍乱、伤寒、结核及痢疾等多种疾病的病原菌,种类较多,生长很快,分布广泛,危害严重。化学药剂灭蝇,不仅杀虫效果差,而且环境污染严重。生物防治蝇蛆,不仅能避免污染,而且可在蝇蛆中间不断传染,药效较长。但是,目前在国内外尚未见到有这方面的研究报告,仅见到刘世贵等利用类产碱假单胞菌防治草地蝗虫的报道。     

Bacterial uptake of octyl ethanolamine increases with pH

The uptake of octyl ethanolamine (C8EA) by Pseudomonas pseudoalcaligenes was determined at pH 7.1-10.0. At pH 9.1 the total uptake was nearly three times higher and at pH 10.0 four times higher than at pH 7.1. Also the initial rate of uptake was lowest at pH 7.1. At pH 7.1 five to ten times higher concentrations of C8EA were needed than at pH 9.1 to achieve the same degree of leakage of cytoplasmic constituents. The results support the hypothesis that penetration of the bacterial cytoplasmic membrane by C8EA in its uncharged form is favoured. This takes place particularly with high pH in the suspending medium. In the cytoplasm, the pH is lower, and C8EA becomes more protonated. This will prevent back diffusion, promote accumulation and enhance membrane interaction and toxicity at high pH.