酶母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报道基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏ８ｍｙｃｅｓｅ ｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比     

12株酵母菌的亲缘关系分析

克隆了９株假线酵母和１株克鲁维酵母的２５ＳｒＤＮＡ片段,测定其５′端部分苷酸序列与报道的Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ及Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２５ＳｒＤＮＡ相应区域的核苷酸序列比较,采用ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ和ｂｏｏｔ－ｓｔｒａｐ法分析并绘制系统树,结果提示ＣａｎｄｉｄａｋｅｆｙｒＣＢＳ８３４与Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓＣＢＳ４８５７亲缘     

雄激素受体与雄激素应答元件的相互作用

将雄激素受体（ＡＲ）的ｃＤＮＡ１１１９ｂｐ片段（１１０５－２２２４）（其中包含其ＤＮＡ结合结构域到部分激素结合结构域）克隆于表达南粒ｐＧＥＸ中,通过ＩＰＴＧ诱地,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达ＧＳＴ－ＡＲ融合蛋白,经谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ亲和层析得以部分纯化。利用一个有雄激素应答元件（ＡＲＥ）活性的Ｃ３（１）ＤＮＡ片段为阳性探针,通过凝胶阻滞分析和ＤＮａｓｅ１足迹法证明此表达产物具有牧民的ＤＮＡ     

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

ＣＳ３是某些肠毒素大肠杆菌菌体表面上的多聚物,它能使病原菌粘附于宿主的小肠上皮细胞上,是致病的重要因素．为了探索ＣＳ３菌毛抗原基因的表达调控机制,根据ＣＳ３亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着ｒｂｓ位点及原核启动子的－１０区和－３５区ＤＮＡ序列．采用基因重组技术将ＣＳ３结构基因上游１２０ｂｐ的ＤＮＡ片段亚克隆进缺乏启动子而只含报告基因ｌａｃＺ的质粒ｐＣＢ２６７中．凝胶滞留和启动报告基因表达的实验证明了ＣＳ３亚基结构基因具有自身的启动子（Ｐｓ）．将该启动子上游区域不同长度的核苷酸片段克隆进ｐＣＢ２６７中,报告基因表达结果表明ＣＳ３结构基因的表达受其上游区域的抑制．核苷酸序列分析发现,在Ｐｓ－３５区上游５５０ｂｐ和８４０ｂｐ处各存在一个富Ａ－Ｔ簇．结合原核启动子的一般作用规律推知,ＣＳ３的表达可能受ＤＮＡ结合蛋白型的正向调节因子的作用．用ＣＦＡ／１菌毛抗原基因的正向调节基因ｃｆａＤ对ＣＳ３基因进行的互补表达试验表明ｃｆａＤ基因不仅可消除上游区对Ｐｓ的抑制,而且可大幅度地提高Ｐｓ的启动能力．在分析表达调控的基础上获得ＣＳ３重组高效表达．同时提出了其表达调控模型．     

7号淀粉酶链霉菌M1033木糖异构酶基因的启动子活性检测、转录起始点的确定

分别从重组质粒ｐＵＢ１及其Ｍ（１３）亚克隆Ｓ１中将７号淀粉酶链霉菌（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓＮｏ．７）Ｍ１０３３（以下简称Ｓ．ｄｉ．Ｍ１０３３）木糖异构酶基因的－１９２－＋５８１ｂｐ片段克隆入链霉菌启动子探测质粒ｐＩＪ４０８３中,转化变铅青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４。通过对其邻苯二酚加双氧酶活性的检测表明,该片段具有启动子活性。应用Ｍ１３亚克隆Ｓ１和合成引物Ｐ６延伸制备放射性标记的单链ＤＮＡ探针;通过Ｓ．ｄｉ．Ｍ１０３３的总ＲＮＡ的Ｓ１核酸酶保护实验,确定了其转录的起始位点,并由此探讨了与木糖异构酶基因表达有关的一些因素。     

雄激素受体融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与纯化

将雄激素受体的ｃＤＮＡ片段克隆到表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ内,在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,得到可溶性表达产物ＧＳＴ－ＡＲ。用该融合蛋白制得的兔多克隆抗体,经ＧＳＴ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ亲和吸附纯化后,表现出较好的抗ＡＲ的专一性,可用于ＡＲ结构和功能的研究。     

小鼠金属硫蛋白 Ⅰ cDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ｐＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ｐＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确．再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ／Ｌ     

小鼠白细胞介素12双顺反子真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

克隆小鼠白细胞介素１２（ＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ,并构建同时含ｍＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５ｃＤＮＡ的双顺反子真核表达载体及其在哺乳动物细胞中的表达．白细胞介素１２是由巨噬细胞,树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子,对机体的细胞免疫功能起着重要的调节作用．利用脂多糖（１００ｐｇ／ｍｌ）和小鼠重组干扰素（ＩＦＮ－γ５００Ｕ／ｍｌ）体外联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞,从中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出含信号肽的小鼠白细胞介素１２（ｍＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５全长ｃＤ－ＮＡ．ＰＣＲ产物经酶切后,分别克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体中,序列测定结果与文献报道序列一致．然后利用脊髓灰质炎（Ｐｏｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）连接ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ,亚克隆至ｐｃＤＮＡ３载体中,构建成含ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ双顺反子真核表达载体,即ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２,ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ同时受ｐｃＤＮＡ３中ｈＣＭＶ启动子驱动,将ｐ４０及ｐ３５转录至同一ｍＲ－ＮＡ上．通过ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ将ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２转染ＣＯＳ－７细胞,７２ｈ收集培养上清,测定ｍ     

酵母K.fragilis甘油醛—3—磷酸脱氢酶基因的克隆

根据已克隆的马克斯克鲁维酵母（Ｋ．ｍａｒｘｉａｕｓ）,乳酸克鲁维酵母（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）与酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅｉａｅ）甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＧＡＰ）基因的核苷酸序列同源性分析设计ＧＡＰ探针,以该探针与脆壁克鲁维酵母（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＣＢＳ３９７基因文库进行原位杂交,得到一阳性克隆ｐＧ１并通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交实验得以证实。该克隆所携带的ＧＡＰ１基因的部分序列也已被测定。利用     

枯草芽孢杆菌bgIS基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－１,３－１,４－葡聚糖酶基因（ｂｇＩＳ）２．７ｋｂＥｃｏＲＩ片段和酵母染色体ｒＤＮＡ片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列（Ａｕｔｏｎｏｍｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒ＹＩＰ５上,构建成ＹＩＰ５－ｂｇＩＳ－ｒＤＮＡ的杂种质粒ＰＣＺＨ,转化Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ并得到表达。稳定性测定表明,Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０１）和Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０４）