肠道病毒71型外壳蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒pPIC9K/VP1,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,甲醇诱导表达。SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为34kD,与天然VP1大小一致。凝胶薄层扫描分析显示:目的蛋白表达量占培养上清总蛋白的60%以上。ELISA实验表明,重组蛋白VP1具有较好的抗原性。使用饱和硫酸铵分级沉淀法初步纯化的表达产物,能够较特异性地与EV71感染者血清中的抗体产生反应,而且与抗柯萨奇病毒A16特异性抗体不产生反应。通过利用表达产物作为抗原,对156份血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的的检测用抗原。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1全长在大肠杆菌中的高效表达及初步活性测定

目的:重组表达肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1全长,用于研制血清学检测试剂和疫苗研发。方法:在获得EV71全长基因并测序正确的基础上,将外壳蛋白VP1全长基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用双抗原夹心检测技术评价重组抗原与27份EV71抗体阳性血清和18份阴性血清的反应情况。结果:重组EV71-VP1蛋白在大肠杆菌中诱导6 h后可获得高效表达,能与27份EV71抗体阳性血清中的21份发生阳性反应,EV71双抗原夹心检测与中和血清测试结果具有很好的一致性(P0.05)。结论:实现了肠道病毒71型外壳蛋白VP1的高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

前列腺特异膜抗原在Pichia pastoris酵母中的表达及鉴定

前列腺特异膜抗原是一种具有高度前列腺特异性的糖蛋白 ,其表达的增高与肿瘤的术后复发、激素抵抗及较差的预后正相关 ,在前列腺癌的诊断和治疗中有广泛的应用前景 .从前列腺癌组织提取总RNA ,利用RT PCR技术获得PSMA基因的全长序列 ,构建了重组酵母表达载体pPIC3.5K PSMA .电击法转化Pichiapastoris酵母 ,通过表型筛选和PCR鉴定证实该基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .SDS PAGE显示 ,获得的PSMA蛋白分子量约 10 0kD ,表达产物经West ern印迹证实可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合 .结果表明 ,成功地获得PSMA编码的cDNA并在酵母细胞中获得表达 .     

肠道病毒71型的研究进展

肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员,其感染主要引起患者手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD).通常情况下,EV71感染引起的HFMD在临床症状等方面与柯萨奇病毒A16(Coxsackie A16,CA16)引起的手足口病难以区别,但EV71感染除了引起HFMD以外,还能够引起无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、脑干脑炎(brainstem encephalitis)和脊髓灰质炎样的麻痹(poliomyelitis-like paralysis)等多种与神经系统相关的疾病[1].自1974年首次报道[2]以来,EV71已在世界范围内引起十多次爆发与流行[3-6].近年来,EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势[7-9].根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的差异,可将EV71分为A、B、C 3个基因型,其中,B型和C型又进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1和C2亚型[10-12].     

人胰岛素在甲醇酵母Pichia pastoris中的分泌表达

将猪胰岛素前体基因和在其５’端引入９个氨基酸的间隔肽序列的ＰＩＰ基因插入到Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ的分泌表达质粒ｐＰＩＣ９中,得到分泌表达质粒ｐｐＩＣ９／ＰＩＰ和ｐＰＣ９／ｓｐ－ＰＩＰ７并用以转化ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５。用点杂交筛选,获得高拷贝转化Ｐ３９（－ｓｐ）和Ｓ５１（＋ｓｐ）。     

肠道病毒71型2A蛋白的研究进展

肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)是手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)主要致病原之一。手足口病临床上常表现为发热,手掌、脚掌及口腔黏膜皮疹或疱疹。然而,EV71感染导致的手足口病易伴随神经系统并发症,甚至死亡。EV71非结构蛋白2A作为蛋白酶和转录激活因子,在EV71生命周期中发挥重要作用。本文对2A的结构与功能研究进展进行综述,揭示2A的双重功能如何促进病毒复制和调控靶细胞,为进一步研究靶向2A的抗病毒疫苗和药物提供理论基础。     

鼠卵透明带3在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

本研究通过酵母Pichiapastoris表达鼠卵透明带 3(mZP3)蛋白 ,获得控制害鼠生育研究的抗原物质。根据国际基因库已发表的mZP3基因序列设计引物 ,并分别在 5’引物和 3’引物中引入EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增 ,将mZP3克隆至穿梭质粒pGAPZαA上 ,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA mZP3经线性化后 ,采用LiCl法转入毕赤酵母SMD1 1 68菌株中 ,Zeocin+ 筛选阳性克隆 ,酵母发酵上清液进行SDS PAGE和Western blot检测 ,结果表明mZP3在酵母中得到了特异性表达 ,表达产物的分子量约为 60kDa ,说明mZP3能够在酵母真核系统中成功表达 ,并可以用作mZP3免疫不育控制鼠害的检测抗原。     

肠道病毒71型分子流行病学研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71),自1974年首次报道以来,在世界范围内引起多次爆发与流行。EV71感染主要引起患者手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD),在临床上与柯萨奇病毒A16(Coxsakie A16,CA16)感染所引起的手足口病难以区别,但EV71还能够引起多种与神经系统相关的疾病。近年来,EV71病毒的流     

人可溶性gp190在酵母Pichia pastoris中的表达

人可溶性gPl90(sgp190)是白血病抑制因子(LIF)的可溶性受体,可能在LIF行使众多生物学功能中扮演着重要的角色。为获得这一蛋白以研究它在人体内的生物学活性,在酵母Pichia pastoris中实现了重组sgp190分泌表达。利用基因重组技术,将编码人可溶性gP190(LlF受体α亚基gP190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgp190。原生质体法转染Pichia pastoris GS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgp190蛋白的毕赤酵母菌株GS115／pPIC9K-sgp190,sgp190蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的26％。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125kD,具有免疫活性。对sgp190体外活性分析表明它能够抑制LIF诱导滋养层细胞分泌hCG。     

抗肠道病毒71型的药物研究进展

肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）是引起重症手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）的主要病原体。重症HFMD进展迅速,可表现为严重的神经系统并发症,甚至危及生命。目前临床上防治EV71感染缺乏特异、高效的药物,其残疾率和死亡率很高。随着研究的深入,已经发现了大量具有抗EV71能力的化合物,人们探索的药物机制和药物靶点各不相同。因此,本文从药物靶向病毒、宿主等角度出发,针对抗EV71感染的天然药物、合成药物及常见中药中活性成分作用机制的最新进展进行综述与讨论。此外,对抗病毒药物筛选技术进行简要概述,以期为抗EV71药物的筛选与研发设计等相关研究提供参考。     

肠道病毒71型感染患儿血中炎症因子mRNA的表达

目的探讨肠道病毒71型(EV71)感染患儿血中炎症因子mRNA的表达。方法用Real-time PCR方法检测EV71感染轻症、重症患儿和正常儿童的血中肿瘤坏死因子α(TNF-α),干扰素(IFN)-α、IFN-β,白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、IL-12的mRNA表达。结果EV71感染患儿血中IFN-α、IL-6、IL-8、IL-12mRNA的表达增加(28±182.07 vs 5.5±0.79;30±103.30 vs 6±4.21;34±169.60 vs6.2±4.16;33.33±229.70 vs 2.6±0.92)。轻症组与重症组间比较,IFN-α、IL-12mRNA表达显著升高(40±275.86 vs 28±182.07;46.67±46.04 vs 33.33±229.7),IL-6、IL-8mRNA的表达差异无统计学意义(30±103.3 vs 32±110.5;34±169.6 vs 36.67±195.4)。结论细胞因子IFN-α、IL-6、IL-8、IL-12参与抗EV71感染过程,其中IFN-α和IL-12可能是促进EV71感染发展为重症的关键因子。     

人基质金属蛋白酶-9在酵母Pichia pastoris中的表达

基质金属蛋白酶 - 9( MMP- 9)可促进恶性肿瘤的侵袭、转移 ,并在组织重建、胚胎发育以及伤口愈合等生理过程中发挥重要作用 .为研究这一蛋白的性质 ,并以之为靶标筛选抗肿瘤转移药物 ,在酵母 Pichia pastoris中实现了重组人 MMP- 9蛋白的高效、高活性、分泌表达 .首先用 PCR扩增了 MMP- 9基因编码区 (不含信号肽序列 ) ,经测序证实后 ,将其插入 p PIC9质粒中 ,构建表达载体 .用 Li C1 - PEG法转化酵母后 ,采用明胶 -酶谱法筛选获得 5株高效分泌表达 MMP- 9的克隆 ,经PCR证实 MMP- 9基因整合在阳性克隆的染色体中 .重组蛋白分子量为 93k D,表达量为 1 0 mg/L.重组蛋白可水解明胶及 型胶原 ,并可经有机汞 APMA诱导发生自剪切 ,转换成 85k D的激活形式 ,表明重组蛋白具有与天然人 MMP- 9蛋白相似的底物水解活性和自剪切激活特性 .     

细胞焦亡在肠道病毒A71型感染中的作用

肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)是引起手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)最常见的病原体之一,而细胞焦亡是一种以细胞溶解及炎症反应为主要特征的细胞程序性死亡。目前细胞焦亡参与EV-A71致病的分子机制尚不清楚。本研究旨在探索EV-A71感染引起的焦亡与病毒感染之间的关系。EV-A71感染Vero细胞,6 h后检测caspase-1 mRNA和蛋白的表达水平,结果显示EV-A71感染促使caspase-1表达升高,表明EV-A71感染引起细胞焦亡;检测IL-1β和IL-18 mRNA和蛋白的表达水平,结果显示EV-A71感染促进IL-1β和IL-18的表达升高,表明EV-A71诱导的焦亡与炎症的产生有关。EV-A71感染后加入caspase-1抑制剂Ac-YVADCMK,在感染后6 h检测caspase-1和EV-A71的mRNA和蛋白的表达水平,结果显示加入Ac-YVAD-CMK可降低caspase-1和EV-A71的mRNA及蛋白水平,表明Ac-YVAD-CMK可抑制细胞焦亡和病毒的感染;检测IL-1β和IL-...     

肠道病毒71型3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达及活性研究

本研究利用大肠杆菌表达系统构建肠道病毒71型3C蛋白酶,并进行纯化,对其酶活性进行研究。首先,将3C蛋白酶基因克隆至pET28a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化获得3C蛋白酶,经肠激酶酶切去除N端His标签后获得无His标签的3C蛋白酶,再以荧光多肽为底物进行酶活性研究。经过双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET28a-3C构建正确,表达的重组3C蛋白酶相对分子质量约22kD;纯化后有无His标签的3C蛋白酶均能催化荧光底物3B-3C,并且两者的酶动力学数据无显著差异,含有His标签的3C蛋白酶Km、Vmax、Kcat分别为22μM、434nM.Min-1、0.0669 Min-1;其最适反应pH为7.0,最佳反应温度为30℃～37℃。本实验成功表达并纯化了重组3C蛋白酶,该酶具有良好的活力,为抗病毒抑制剂、结构蛋白组装、疫苗开发及3C蛋白酶检测方法的研发奠定了基础。     

重组人载脂蛋白A-Ⅰ在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高表达

高密度脂蛋白(High-density Lipoprotein,HDL)是血浆中重要的脂蛋白,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(Apoliprotein AⅠ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白,首先尝试利用Pichia pastoris表达系统高效表达ApoAⅠ。通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段,将其插入到P．pastoris分泌型载体pPIC9K上,BglⅡ酶切线性化后电转化P．pastoris GS115,将获得的1000多个转化子依次在含不同G418浓度的YPD平板筛选高抗性转化子,得到的22个高抗性转化子经甲醇诱导,SDS-PAGE检测得到6株高表达菌。然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化,结果显示：接种后培养24～28h,转入诱导阶段,培养基pH值在7—7．5,菌体密度OD600=80左右,以1％甲醇诱导96h最有利于ApoAⅠ的表达,表达水平达160mg／L。14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当,均高于其它表达系统,为大批量制备奠定了基础。     

肠道病毒71型与天然免疫系统相互作用的研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)为小RNA病毒科肠道病毒属成员,是引起手足口病的主要病原体之一。EV71流行广泛,其感染可引发中枢神经系统疾病,并造成重症手足口病,给公共卫生安全带来极大挑战。EV71的致病机制与病毒和宿主天然免疫系统的相互作用关系密切,涉及病毒逃逸干扰素反应、病毒抑制核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信号通路及病毒与天然免疫细胞相互作用等多个环节。本文就近年来EV71与宿主天然免疫系统相互作用的研究进展进行综述。     

双价外壳蛋白基因植物表达载体的构建及马铃薯转基因植株的鉴定

在克隆了马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ 病毒（ＰＶＹ）和马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）的外壳蛋白基因的基础上,构建同时包含ＰＶＸ和ＰＶＹ 与ＰＶＹ 和ＰＬＲＶ 两个外壳蛋白基因植物表达框架的表达载体,通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导转化烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ ）和生产上常用的几个马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ）优良品种：“Ｆａｖｏｒｉｔａ”、“虎头”、“克４”。经ＰＣＲ检测证明外源基因已整合到植物的染色体上,得到批量转基因植株。在转ＰＶＸ＋ＰＶＹ 外壳蛋白基因的烟草上接种ＰＶＸ （５ μｇ／ｍ Ｌ）、ＰＶＹ（２０ μｇ／ｍ Ｌ）病毒,得到有一定抗性的植株     

Toll样受体和细胞因子在肠道病毒71型感染的SW620细胞中的表达分析

目的观察肠道病毒71型(EV71)感染人结肠癌SW620细胞中Toll样受体(TLRs)和细胞因子的表达,为EV71感染机制研究提供依据。方法用荧光定量RT-PCR检测EV71感染人结肠癌SW620细胞后24、48和72 h TLR3、TLR7、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、IL-12 mRNA表达量。结果接种EV71后72 h TLR7mRNA表达量增加,TLR3 mRNA表达无变化。IL-6、IL-8和IL-12分别在接种EV71后24、48和72 h开始表达增加,IL-6、IL-8随着时间延长表达量持续增加。结论 TLR7参与介导了抗EV71感染过程,除TLR7外还有其他TLRs参与其中。IL-6、IL-8和IL-12有序地被活化参与抗EV71免疫反应。     

肠道病毒71型灭活疫苗免疫恒河猴在攻毒实验中的感染动力学

本文旨在根据前期研究建立的恒河猴感染动物模型,对同期研制的肠道病毒71型(EV71)实验性灭活疫苗免疫动物进行全面的免疫保护性评价。评价指标包括病毒攻击后动物体内病毒载量及病理学变化,根据所得结果进行实验性疫苗免疫后动物在病毒攻击中的感染动力学分析。3个疫苗剂量(20、80、320EU)免疫的恒河猴均出现不同效价的中和抗体,80EU和320EU剂量组在二次免疫后第6周抗体效价达1∶128～1∶256,经104.5CCID50病毒鼻腔攻击后均未检出阳性病毒载量。20EU剂量组中,淋巴器官、中枢神经系统及其他主要脏器均出现比对照组低但仍为阳性的病毒增殖现象。病理学方面,各剂量组免疫恒河猴的中枢神经系统以及肺等器官均未出现相关病理损伤。本实验在确定该疫苗对恒河猴有效保护性的同时,亦为明确EV71灭活疫苗免疫剂量提供了直接的实验依据。