P-TEFb的功能及其活性调控机制

P-TEFb是调控真核基因转录延伸的核心转录因子之一,为大多数mRNA转录所必需;与艾滋病、心肌肥大和肿瘤均有密切关系;目前有关P-TEFb的生物学功能及其活性调控机制仍在不断的发现之中。在细胞内,P-TEFb以无活性和可被募集两种复合体存在,并且两种复合体之间可互相转化,以严格维持细胞内P-TEFb的总体活性水平。近年的研究已逐渐揭示P-TEFb活性调控的分子模式,以及调控细胞内P-TEFb活化的信号和分子机理。本文综述近年有关P-TEFb的功能和活性调控机制的研究进展。     

黄淮麦区小麦子粒多酚氧化酶活性基因等位变异的分子检测

摘要: 籽粒多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性是造成面粉以及面制品褐变的主要因素,了解不同小麦品种籽粒PPO活性基因的等位变异情况,有助于遗传改良中提高面制品的外观品质。本研究利用2A染色体上Ppo-A1的标记PPO18以及2D染色体上Ppo-D1的标记PPO16和PPO29检测该基因在118份黄淮麦区小麦品种中的等位变异。结果表明：在Ppo-A1位点,48.3％的小麦品种含Ppo-A1a（高PPO活性）型等位基因,51.7％的小麦品种含Ppo-A1b（低PPO活性）型等位基因,Ppo-A1a和Ppo-A1b两者之间的差异达到显著水平（P﹤0.05）。在Ppo-D1位点,55.1％的小麦品种含Ppo-D1a（低PPO活性）型等位基因,44.9％的小麦品种含Ppo-D1b（高PPO活性）型等位基因,Ppo-D1a和Ppo-D1b两者之间的差异也达到显著水平（P﹤0.05）。在Ppo-A1和Ppo-D1两个位点共检测到Ppo-A1a/Ppo-D1a（中间型PPO活性)、Ppo-A1a/Ppo-D1b（高PPO活性）、Ppo-A1b/Ppo-D1a（低PPO活性）、Ppo-A1b/Ppo-D1b（中间型PPO活性）四种变异组合类型,分布频率分别为28.8％、19.5％、26.3％和25.4％,彼此之间的差异均达到显著水平（P﹤0.05）。总体来看,这三个基因特异性标记可以快速、准确和方便的检测籽粒PPO基因的不同等位变异。此外,本研究检测出部分材料具有低PPO活性,可为选育具有低PPO活性的小麦品种提供有用信息。     

嵌合中国分离株基因的丙型肝炎病毒（1b／2a）细胞培养模型的建立

目的：建立嵌合中国分离株基因的丙型肝炎病毒（HCV）细胞培养模型。方法：利用3片段融合PCR的方法将中国HCV河北分离株（1b）的全长包膜蛋白基因引入JFH1（2a）株基因骨架,构建包膜蛋白基因区相互置换的嵌合HCV（1b／2a）全长基因组,经线性化后体外转录获得全长RNA,转染Huh7．5．1细胞系,用免疫荧光及蛋白印迹实验检测。结果：该RNA可以产生具有体外感染活性的嵌合HCV,且感染性可在共同培养的细胞间传播。结论：首次在国内建立了嵌合中国HCV分离株基因的HCV细胞培养体系。     

转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达

为研究Ebox元件在谷氨酸 半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox（-3 853～ -3 848）的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（L2）,比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2（differentiated embryo chondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2）真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）和超级迁移率实验（supershift assay）检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响. 结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(－3 853～－3 848）与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western 印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox（－3 853～－3 848）有关.     

乳腺癌雌激素受体β不同亚型表达载体的构建及其转录活性分析

目的：构建人乳腺癌中雌激素受体B（ERβ）3种亚型ERβ1、ERβ2和ERβ5的真核表达载体,测定不同亚型ERβ的转录活性。方法：以乳腺癌细胞MCF7的cDNA为模板,PCR扩增ERβ1、ERβ2和ERβ5万基因,分别克隆到pXJ40-Mye载体,Western印迹检测克隆载体在293T细胞内的表达;将上述载体与含雌激素应答元件（ERE）的萤光素酶（Luc）报告基因载体（ERE—luc）共转293T细胞,测定各亚型ER／3的转录活性。结果：构建了Myc—ERβ1、Myc—ERβ2和Mye—ERβ5表达载体,转录活性结果显示上述表达载体均具有活性,雌激素可升高ERβ5的转录活性,不能升高Eβ2和ER5的转录活性。结论：该研究为进-步探讨不同亚型ERβ在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

雌激素受体β转录激活系统的构建

目的：构建雌激素受体β（ERβ）的转录激活系统。方法：以pcDNA3-ERβ质粒为模板,利用PCR技术扩增ERβ全长及转录激活结构域1（AF1）、DNA结合结构域（DBD）、转录激活结构域2（AF2）等不同长度的基因片段,分别插入pGAL载体中,构建重组质粒,转染293T细胞,利用免疫杂交方法鉴定其表达情况,用萤光素酶报告基因（Gal4-LUC）检测转录活性。结果：构建了ERβ全长及不同功能区片段编码基因的重组质粒,转染293T细胞后检测到相应蛋白的表达;在活性实验中,雌激素（E2）诱导下pGAL-ERβ使Gal4-LUC活性升高约17倍,pGAL-ERβAF1在有无E2诱导下均能使Gal4-LUC活性升高2倍,pGAL-ERβAF2在E2诱导下使Gal4-LUC活性升高约7倍,pGAL-ERβDBD对Gal4-LUC活性没有明显作用。结论：ERβ的转录激活系统构建成功。