体细胞基因打靶-核移植技术研究进展

转基因效率与外源基因表达水平低的现状一直是制约动物生物反应器研究与产业化的主要技术瓶颈。体细胞克隆动物的成功和胚胎干细胞基因打靶技术的逐步完善使得体细胞基因打靶与核移植技术的结合使用成为可能,这就为生产遗传修饰家畜提供了一种新的手段,为动物生物反应器的成功研制提供了新的技术途径。从体细胞基因打靶的载体设计、转染系统的建立、中靶细胞的筛选和鉴定以及培养体细胞寿命等方面阐述了体细胞基因打靶—核移植技术体系的最新研究进展,并对其在异种器官移植、建立动物疾病模型、提高家畜生长性能以及生产药用蛋白等各个领域中的应用前景作了展望 。     

体细胞基因打靶制备动物乳腺生物反应器的策略与应用

在转基因动物研究中,由于基因表达调控元件的人工拼接和外源基因在动物基因组中随机整合所带来的“位置效应”,致使转基因动物外源基因的表达水平不高并且差异较大。为此,利用定位整合优势,对以基因同源重组为基础的基因打靶技术进行了大量研究。介绍了就利用体细胞基因打靶和核移植技术制备动物乳腺生物反应器的策略和应用情况做一综述,并对提高基因打靶效率的各种策略,打靶细胞的选择,转基因细胞核移植的低融合事件以及基因打靶制备乳腺生物反应器的优越性进行分析。     

基因打靶技术在乳腺生物反应器中的应用

利用转基因动物的乳腺生产人类重组蛋白,可以获得安全而有效的药用蛋白.目前采用的转基因技术由于其固有的局限性,未能使乳腺生物反应器的研究取得长足的进步.基因打靶克服了随机整合的盲目性和危险性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法.简述了制备乳腺生物反应器过程中靶细胞、基因打靶的策略、打靶位点及问题,并对其发展方向进行了小结及展望.     

基因打靶突变小鼠与基因功能研究

ES细胞是建立基因打靶突变小鼠的必要条件 ,也可用于制备转基因动物 .基因敲除、精细突变和条件性基因打靶技术建立的基因打靶突变小鼠在人类遗传病机理研究、基因治疗和基因功能研究方面都有着重要作用 .     

哺乳动物克隆的研究进展与应用前景

显微注射技术本身固有的缺点在很大程度上限制了转基因动物的研究及应用。近年来,体细胞基因打靶和体细胞克隆的最新研究进展表明,这两种技术相结合将成为制备大型转基因动物的有效途径。     

植物基因打靶研究现状

基因打靶是八十年代后期发展起来的一门新兴的遗传工程技术,基因打靶技术在探索生物的基因功能,消除转基因的沉默,提高转基因的稳定性和表达效率以及基因治疗等方面均取得了进展。基因打靶技术的应用前景广阔,它的产生是遗传工程领域的一次革命。目前,基因打靶在植物上的应用研究才刚起步。本文针对基因打靶在植物上的研究现状作一综述。     

基因打靶技术:开启遗传学新纪元

基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标的过程中发挥着重要的作用。近年来, 随着条件基因打靶技术的发展使基因失活可以限制在特定时段特定组织或细胞内。文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在其他模式动物中的应用。     

动物转基因新技术研究进展

动物转基因技术是21世纪发展最为迅速的生物高新技术之一,它是指通过基因工程技术将外源基因整合到受体动物基因组中,从而使其得以表达和遗传的生物技术。动物转基因的关键限制因素是转基因效率和基因表达的精确调控。目前有多种转基因技术,每一种技术各有其优缺点,仍然需要进一步研究。随着研究的深入,转基因技术必将在探讨基因功能、动物遗传改良、生物反应器、动物疾病模型、器官移植等领域有广阔的应用前景。文章综述了近年发展的提高转基因效率的生殖干细胞法、提高转基因精确性的基因打靶法、RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默技术和诱导多能干细胞(iPS)转基因技术。新的转基因技术为转基因动物的研究提供了更好的平台,可以加快促进人类医药卫生、畜牧生产等领域的发展。     

植物基因打靶研究现状

基因打靶是八十年代后期发展起来的一门新兴的遗传工程技术,基因打靶在探索生物的基因功能,消除转基因的沉默,提高转基因的稳定性和表达效率以及基因治疗等方面的均取得了进展,基因打靶技术的前景广阔,它的产生是遗传工程领域的一次革命。目前,基因打靶在植物上的应用研究才刚起步。本文针对基因打靶在植物上的研究现状作一综述。     

克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

动物转基因研究中的技术方法

转基因动物研究的深入为生物学的发展起到了巨大的推动作用。转基因新技术的不断出现,推动了转基因动物的发展。介绍了几种哺乳动物转基因研究中常见的方法,包括原核显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、生殖细胞介导法、基因打靶以及新的比较有应用前景的方法,如PiggyBac、iPS,锌指核酸酶法,并且分别对每种方法的优缺点进行了总结归纳。     

转基因动物新技术研究进展

转基因技术经过数十年的发展日渐成熟,并推动转基因技术研究进入一个新的发展阶段。文章综述了体细胞核移植技术、慢病毒载体法、转座子介导的基因转移法、RNA干扰介导的基因敲除法和锌指核酸酶-基因打靶技术等近年发展起来的方法。而近来诱导多能干细胞(iPS细胞)的成功为尚未获得ES细胞的大动物建立多能干细胞系提供了一种新的方案,为转基因动物研究开创一片更广阔的天地。文章在前人研究的基础上重点总结了以上各种转基因技术的最新研究动态并对各种转基因技术的特点进行了探讨。     

转基因动物克隆技术的应用及生物反应器的建立

利用转基因克隆技术实现外源基因的导入宿主染色体基因组内稳定整合,并能遗传给后代,已在基因表达与调控的理论研究、人类遗传病动物模型的建立、药用蛋白的生产、抗病育种、人类移植用的器官的研究等方面得到广泛应用。转基因动物的研究与应用也已经成为21世纪生命科学领域最活跃、最具有实际应用价值的方向之一,尤其是作为生物反应器和医学上为人类提供所用器官方面,其经济价值和社会效益将是不可估量。在查阅大量近年来国内外相关资料的基础上,本文以转基因动物克隆为中心,对转基因动物克隆所采用显微注射技术、核移植技术、基因打靶与真核BAC表达载体制备等主要研究技术,以及转基因动物克隆在异种器官移植、构建生物反应器等方面的应用进行了综合性论述与分析,同时阐述了各种转基因技术的优点与缺点,以其为转基因动物克隆研究提供理论基础与技术支撑。     

Viral infection resistance conferred on mice by siRNA transgenesis

RNA interference is an attractive strategy to fight against viral diseases by targeting the mRNA of viral genes. Most studies have reported the transient delivery of small interfering RNA or small hairpin (shRNA) expression constructs. Here, we present the production of transgenic mice stably expressing shRNA or miRNA targeting the IE180 mRNA (immediate early gene) of the pseudorabies virus (PRV) which infects mice and farm animals. We firstly designed non-retroviral shRNA or miRNA expression vectors. Secondly, we selected the most efficient shRNA construct that targeted either the 5′part or 3′UTR of the IE mRNA and was able to knockdown the target gene expression in cultured cells, by measuring systematically the shRNA content and comparing this with the interfering effects. We then produced four lines of transgenic mice expressing different amounts of shRNA or miRNA in the brain but without signs of stimulation of innate immunity. Lastly, we tested their resistance to PRV infection. In all transgenic lines, we observed a significant resistance to viral challenge, the best being achieved with the shRNA construct targeting the 3′UTR of the IE gene. Viral DNA levels in the brains of infected mice were always lower in transgenic mice, even in animals that did not survive. Finally, this work reports an effective strategy to generate transgenic animals producing shRNA from non-retroviral expression vectors. Moreover, these mice are the first transgenic animal models producing shRNA with a significant antiviral effect but without any apparent shRNA toxicity.     

A construct with fluorescent indicators for conditional expression of miRNA

Background  

Transgenic RNAi holds promise as a simple, low-cost, and fast method for reverse genetics in mammals. It may be particularly useful for producing animal models for hypomorphic gene function. Inducible RNAi that permits spatially and temporally controllable gene silencing in vivo will enhance the power of transgenic RNAi approach. Furthermore, because microRNA (miRNA) targeting specific genes can be expressed simultaneously with protein coding genes, incorporation of fluorescent marker proteins can simplify the screening and analysis of transgenic RNAi animals.     

锌指核酸酶在基因组定向修饰中的应用

同源重组和逆转录病毒介导转基因法是目前基因组修饰中常用的两种主要方法.由于这些传统方法效率低,特异性差等缺点,制约了其在研究中的应用.锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN）是一种人工合成酶,含有锌指蛋白DNA结合域和非特异性核酸酶FokI结构域. ZFN在对基因组的靶向修饰时,表现出高度特异性和高效性. 最新研究结果显示,锌指核酸酶在哺乳动物细胞和斑马鱼基因组靶向敲除的效率高达20%.这一技术的出现,将给基因组靶向修饰的研究和应用领域带来革命,特别是在基因治疗人类疾病方面有巨大的潜力和广阔的前景.     

Nuclear transfer of goat somatic cells transgenic for human lactoferrin gene

Transgenic animal mammary gland bioreactors are used to produce recombinant proteins with appropri-ate post-translational modifications.The nuclear transfer of transgenic somatic cells is a powerful method to pro-duce mammary gland bioreactors.We established an effi-cient gene transfer and nuclear transfer approach in goat somatic cells.Gene targeting vector pGBC2LF was con-structed by cloning human lactoferrin (LF) gene cDNA into exon 2 of the milk goat beta-casein gene and the endogenous start codon was replaced by that of human LF gene.Goat fetal fibroblasts were transfected with lin-earized pGBC2LF and 14 cell lines were positive accord-ing to PCR and Southern blot.The transgenic cells were used as donor cells of nuclear transfer and some of recon-structed embryos could develop into blastocyst in vitro.     

整合人lactoferrin基因的山羊体细胞支持核移植克隆胚的体外发育

克隆了人lactoferrin基因和山羊[[beta]]-casein基因5′端调控区, 构建了人lactoferrin的乳腺表达载体, 并将该载体利用脂质体介导转染了奶山羊胎儿成纤维细胞, 获得了稳定整合人lactoferrin基因的转基因体细胞克隆17个, 其中PCR和Southern Blot检测阳性的细胞克隆14个, 阳性率82.4%。以转基因体细胞为供体细胞进行了核移植, 获得了能够体外发育的山羊转基因克隆胚胎, 体内成熟卵母细胞来源的核移植囊胚率为64.8%, 体外成熟卵母细胞来源的核移植囊胚率为51.7%, 证明了山羊转基因体细胞能够支持克隆胚的进一步发育。     

Gene targeting from laboratory to livestock: Current status and emerging concepts

The development of methods for cell-mediated transgenesis, based on somatic cell nuclear transfer, provides a tremendous opportunity to shape the genetic make-up of livestock animals in a much more directed approach than traditional animal breeding and selection schemes. Progress in the site-directed modulation of livestock genomes is currently limited by the low efficiencies of gene targeting imposed by the low frequency of homologous recombination and limited proliferative capacity of primary somatic cells that are used to produce transgenic animals. Here we review the current state of the art in the field, discuss the crucial aspects of the methodology and provide an overview of emerging approaches to increase the efficiency of gene targeting in somatic cells.