沉默类胰岛素多肽(Ilp)基因对褐飞虱翅和卵巢发育及海藻糖代谢的影响

【目的】类胰岛素多肽(insulin-like peptide, Ilp)位于胰岛素信号通路最上游,其在糖类物质调控中发挥关键作用。本研究则旨在探究Ilp在褐飞虱Nilaparvata lugens海藻糖代谢平衡的调控作用。【方法】以褐飞虱5龄若虫为实验材料,采用RNAi技术干扰Ilps的表达,观察RNAi后褐飞虱的表型以及雌成虫的卵巢发育。RNAi 48 h与72 h后,采用生化方法测定褐飞虱5龄若虫体内海藻糖、糖原和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性变化;采用qPCR检测海藻糖酶基因(TRE1-1, TRE1-2和TRE2)和海藻糖合成酶基因(TPS1和TPS2)的表达量变化。【结果】dsRNA可有效抑制Ilps的表达,导致褐飞虱出现异常翅型,且注射dsIlp3以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4发现褐飞虱2日龄雌成虫卵巢发育不完全。分别注射dsIlp1-4和dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48 h均能显著提高葡萄糖含量;分别注射dsIlp2, dsIlp3及dsIlp4后48 h显著提高了糖原含量;分别注射dsIlp3和dsIlp4后48 h能够显著提高海藻糖含量,而分别抑制Ilp2和Ilp4 72 h后海藻糖含量显著下降,但注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48和72 h海藻糖含量都显著上升。注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72 h可溶性海藻糖酶活性均显著上升,膜结合型海藻糖酶活性则在分别注射dsIlp3, dsIlp4和dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72 h显著下降;分别注射dsIlp1, dsIlp2和dsIlp4后TRE1-1, TRE1-2, TRE2, TPS1和TPS2的表达量显著下降。【结论】沉默Ilp基因对褐飞虱的发育以及繁殖有一定的阻碍作用,且能够提高褐飞虱体内葡萄糖与糖原的含量,下调海藻糖酶与海藻糖合成酶基因表达量,提高可溶性海藻糖酶的活性,进而调控海藻糖的代谢。     

褐飞虱基因BphMIF1克隆及表达分析

【目的】克隆水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvatalugens唾液蛋白基因BphMIF1,探析BphMIF1在响应褐飞虱取食过程中的表达谱。【方法】采用RT-PCR法克隆了褐飞虱唾液蛋白基因BphMIF1,测序后对序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR(qPCR)对褐飞虱1-5龄若虫及成虫以及不同成虫虫体部位BphMIF1的表达量进行分析,同时对BphMIF1进行了原核表达分析。【结果】克隆得到BphMIF1基因,编码119个氨基酸。qPCR结果表明BphMIF1基因在若虫4龄期表达会迅速上调,在成虫的头、胸、腹均有表达,以腹部表达量最高。原核表达结果显示褐飞虱BphMIF1基因以0.5mmol?L-1的IPTG作为诱导浓度,诱导时间为4h表达效果较好。【结论】BphMIF1基因在褐飞虱成虫头、胸、腹部均有表达,在若虫不同发育历期其表达量有所差异且在4龄若虫时期表达量有显著上调。该结果可为BphMIF1在褐飞虱取食过程中的功能研究奠定基础。     

中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶1基因的分子特性及功能

【目的】通过研究中华稻蝗Oxya chinensis几丁质脱乙酰基酶1 (chitin deacetylase 1, CDA1)基因的分子特性和生物学功能, 为新型农药靶标筛选提供理论基础。【方法】在中华稻蝗转录组数据库搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因片段, 用生物信息学方法对其进行同源比对分析并作聚类关系图; 利用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）获得该基因cDNA全长序列; 通过Real-time quantitative PCR(qPCR)方法检测OcCDA1在5龄若虫不同组织部位和不同发育时期的表达情况, 并采用RNAi技术研究OcCDA1在飞蝗生长发育中的功能。【结果】获得中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶1基因全长cDNA,命名为OcCDA1（GenBank登录号：KP271171）。OcCDA1在前肠、体壁、后肠和脂肪体组织中高表达, 在5龄第1天表达量显著高于以后几天。RNAi结果显示, 注射该基因的dsRNA后, OcCDA1基因的表达量降低了93.3%。OcCDA1基因沉默后虫体出现进食减少、发育迟缓现象, 总死亡率达到95.2%,其中38.1%的试虫在蜕皮前死亡, 57.1%出现因蜕皮困难而死亡的表型。【结论】OcCDA1在中华稻蝗的发育中起着重要作用, 该基因沉默引起虫体进食减少和蜕皮异常从而导致死亡。     

硫激肽及其受体调控褐飞虱取食行为

【目的】明确硫激肽(sulfakinin, SK)及硫激肽受体(sulfakinin receptor, SKR)在褐飞虱Nilaparvata lugens取食行为中的作用。【方法】PCR克隆褐飞虱硫激肽基因Nlsk及其受体基因Nlskr cDNA全长序列并进行生物信息学分析；利用qRT-PCR检测Nlsk及Nlskr在褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)和雌成虫不同组织(头、触角、翅、口针、足、肠道和马氏管)中的表达量；褐飞虱3龄若虫注射dsNlskr进行基因沉默，qRT-PCR检测4龄若虫中Nlskr的表达量，测定4龄若虫的取食量；基于已构建的Nlskr RNAi后的4龄若虫转录组数据库进行差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)的GO和KEGG分析以及取食相关基因的qRT-PCR验证。【结果】PCR克隆得到了褐飞虱Nlsk(GenBank登录号：AB817281)及Nlskr(GenBank登录号：BAO01059.1)的cDNA全长序列。序列比对结果显示，褐飞虱NlSK成熟肽具有与其他物种保守的C端FMRFam...     

褐飞虱过氧化物酶基因NlPOD1的克隆、鉴定及功能分析

【目的】探明褐飞虱Nilaparvata lugens过氧化物酶基因NlPOD1的分子特性、表达模式和生物学功能。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆获得NlPOD1基因全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其序列特征;通过qRT-PCR技术检测NlPOD1在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(头部、脂肪体、血淋巴和肠道)中的表达水平,以及不同微生物(大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae)（1×10⁷/mL）注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术沉默褐飞虱 5 龄若虫NlPOD1基因,并通过生物测定分析NlPOD1基因沉默和接种金龟子绿僵菌(1×108/mL)后褐飞虱的存活率及致死中时(LT₅₀)。【结果】获得褐飞虱NlPOD1全长 cDNA 序列(GenBank登录号: MZ682107),其开放阅读框长2 049 bp,编码682个氨基酸,含有一个典型的动物亚铁血红素过氧化物酶结构域(An_peroxidasedomain),且N端包含一段由29个氨基酸残基组成的信号肽。系统发育分析表明,NlPOD1与半翅目其他昆虫的POD亲缘关系较近,其中与茶翅蝽Halyomorpha halys POD亲缘关系最近。发育表达谱结果表明,NlPOD1在褐飞虱不同发育阶段均有表达,其中卵期表达量最低,5龄若虫中表达量最高;组织表达谱结果表明,NlPOD1在褐飞虱5龄若虫不同组织中均有表达,且肠道和血淋巴中的表达量显著高于头部和脂肪体中的;微生物诱导表达模式表明,与注射PBS的对照组相比,大肠杆菌诱导48 h内各时间点NlPOD1在褐飞虱5龄若虫中的表达量显著上调,而在金黄色葡萄球菌和金龟子绿僵菌诱导下,NlPOD1表达量均呈现先上调后回稳的态势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlPOD1可显著抑制NlPOD1的表达水平。通过RNAi抑制NlPOD1表达后褐飞虱5龄若虫存活率不变,但注射dsNlPOD1联合金龟子绿僵菌感染对褐飞虱5龄若虫的LT₅₀(4.5 d)显著低于注射dsGFP联合金龟子绿僵菌感染的对照组的LT₅₀(5.4 d),说明沉默NlPOD1后褐飞虱对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力显著降低。【结论】NlPOD1在褐飞虱病原防御过程中发挥重要作用,可作为开发RNAi和病原真菌联合介导的褐飞虱防治技术中的一个潜在靶标。     

小菜蛾几丁质酶基因的克隆及表达分析

昆虫几丁质酶参与昆虫蜕皮、消化、防御及免疫等多种生理过程,在昆虫的变态和发育中发挥着重要作用。本研究采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆获得小菜蛾Plutella xylostella几丁质酶基因,命名为PxyChi。该基因开放阅读框长1677 bp,编码558个氨基酸,推测的蛋白分子量为62.03 kDa。氨基酸序列分析表明,小菜蛾几丁质酶第1-19位氨基酸为蛋白的信号肽,且该序列具有典型昆虫几丁质酶的4个保守氨基酸序列。蛋白结构域分析表明,PxyChi属于几丁质酶Group II家族。进化树分析表明:PxyChi与同属鳞翅目二化螟Chilo suppressalis的几丁质酶亲缘关系最近,为75.5%。不同发育时期的荧光定量PCR分析表明,PxyChi在小菜蛾各个发育时期的表达量不同,其中PxyChi在2、3、4龄幼虫、蛹和成虫中的表达量分别是1龄幼虫的28.22、0.76、0.50、84.83和286倍,PxyChi在成虫的表达量最高。暗示PxyChi蛋白可能参与小菜蛾蛹期旧表皮降解和成虫翅的发育等生理过程。本研究可为探索几丁质酶在小菜蛾发育中的功能提供理论依据。     

褐飞虱核糖体小亚基蛋白S8基因NlRPS8的克隆及其表达分析

【目的】核糖体蛋白在生物体内具有重要作用,本研究旨在探明核糖体蛋白S8在褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育过程中的表达规律和功能。【方法】本文根据褐飞虱基因表达谱提供的差异表达基因信息及转录组提供的基因核心序列,结合褐飞虱基因组比对分析,对褐飞虱核糖体S8基因进行了预测,并通过RT-PCR获得了褐飞虱核糖体小亚基蛋白S8的全长c DNA序列,命名为NlRPS8(Gen Bank登录号:KU341337)。【结果】NlRPS8基因全长627 bp,编码208个氨基酸。进化分析表明,褐飞虱与桑粉介壳虫Maconellicoccus hirsutus亲缘关系最为接近。应用荧光定量PCR分析了基因NlRPS8的表达规律,结果表明,NlRPS8基因在褐飞虱怀卵雌虫中表达量最高,而在雄成虫、初羽化雌成虫与1~5龄若虫表达量相对较低;在褐飞虱体内,NlRPS8基因在卵巢中表达量最高,中肠次之,在其他部位表达量较低。在抗性品种ASD7和RHT上,NlRPS8基因表达量分别为感性品种TN1上的1.99倍和2.14倍。NlRPS8基因在经过饥饿处理1 d的褐飞虱组中表达量为正常组的1.6倍。【结论】研究结果显示NlRPS8基因在褐飞虱生长、繁殖中发挥作用,为进一步研究NlRPS8基因在褐飞虱生长发育和对抗性品种适应中的功能提供了线索。     

褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

飞蝗Knickkopf家族基因表达对蜕皮激素的响应

【目的】研究飞蝗LocustamigratoriaKnickkopf(Knk)家族基因mRNA表达对蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）的响应情况,丰富飞蝗Knk家族基因功能研究,为飞蝗表皮发育相关基因的转录调控研究奠定基础。【方法】采用RT-qPCR方法,对LmKnk家族4个基因在飞蝗不同发育天数（5龄若虫第1天到成虫第3天）的表皮中的表达特性进行分析;向飞蝗体腔注射20E,分析LmKnk家族4个基因表达的变化情况;采用RNAi技术干扰20E受体基因LmEcR,分析LmKnk家族基因的表达变化情况。【结果】通过RT-qPCR检测,发现LmKnk在飞蝗5龄第1天至成虫第3天不同发育天数的表皮中均衡表达,而LmKnk2,LmKnk3-FL及LmKnk3-5'基因均在蜕皮前表达量逐渐升高,蜕皮后迅速降低。向飞蝗体腔注射20E后,发现飞蝗Knickkopf家族4个基因对20E均有应答,但响应时间点有差异,LmKnk和LmKnk2的表达量分别在注射20E 3 h和6 h后开始升高,而LmKnk3-FL和LmKnk3-5'的表达量在注射20E12h后开始上升。飞蝗5龄第1天若虫注射ds LmEcR后,发现Knickkopf家族4个基因表达均下调。【结论】飞蝗Knickkopf家族基因的表达受20E调控,是20E的下游应答基因。     

东亚飞蝗中肠几丁质酶基因的克隆、序列分析及组织定位

通过RACE方法,克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Meyen)几丁质酶基因 (LmChi)cDNA全序列 (GenBank 登录号：EF092841)。获得的cDNA全长1 604 bp,其中可读框1 452 bp, 编码483个氨基酸。推测其氨基酸序列与18家族昆虫几丁质酶有较高的相似性。与其他几丁质酶一样,东亚飞蝗几丁质酶序列也包含一个信号肽、一个几丁质酶活性位点、一个碳端丝氨酸富集区和一个几丁质结合域。半定量RT-PCR研究表明,LmChi基因只在东亚飞蝗不同发育阶段的中肠组织中表达,而在东亚飞蝗体壁、前肠和后肠均没有发现LmChi基因的转录。     

氟虫脲对东亚飞蝗和中华稻蝗几丁质合成酶基因表达的影响

为了探讨氟虫脲可能的作用靶标及毒性机制, 本研究以重要农业害虫东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Meyen)和中华稻蝗Oxya chinensis (Thunberg)为材料, 采用简并引物扩增中华稻蝗几丁质合成酶1基因（OcCHS1）的部分cDNA序列; 以氟虫脲浸渍法处理2龄中期中华稻蝗及1, 2和3龄东亚飞蝗若虫为处理组, 丙酮处理为对照组, 使用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法分析氟虫脲对蝗虫几丁质合成酶基因mRNA表达的影响。结果获得的OcCHS1部分cDNA序列, 其长度为312 bp, 编码104个氨基酸, GenBank登录号为HM214491, 与东亚飞蝗几丁质合成酶1基因（LmCHS1）在氨基酸水平上相似度达95％。RT-PCR结果显示, 处理组几丁质合成酶1扩增带均强于对照组。实时荧光定量PCR结果表明: 与对照组相比, 处理组中华稻蝗2龄中期若虫OcCHS1 mRNA表达提高了1.02倍, 东亚飞蝗1, 2, 3龄若虫LmCHS1 mRNA表达分别提高了34%, 82%和89%, 差异显著（P<0.05）。分析基因表达提高的原因是几丁质合成受阻后基因表达水平的一种代偿性增加, 由此推测几丁质合成酶可能是氟虫脲作用的靶标之一。     

飞蝗发育相关基因Omb的克隆、原核表达及时空表达分析

【目的】本研究克隆飞蝗Locusta migratoria发育相关的optomotor-blind(Omb)基因,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解Omb基因在飞蝗翅发育中的作用及为进一步蝗灾的治理和防治提供新的理论依据。【方法】利用RT-RCR扩增飞蝗Omb基因cDNA序列,采用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,利用MEGA 6. 0构建昆虫纲分子系统进化树;构建重组表达载体pET-30a/LmOmb,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析Omb基因在飞蝗不同发育时期及成虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得飞蝗Omb基因部分cDNA序列,命名为LmOmb(GenBank登录号:MG867658),其长792 bp,编码264个氨基酸,在第37-219位氨基酸之间存在一个T-box superfamily保守结构域。同源序列比对分析表明Lm Omb与褐飞虱Nilaparvata lugens Nl Omb氨基酸序列一致性为93%。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR结果显示LmOmb基因在飞蝗不同发育时期均有表达,其中胚胎期的表达量最高,进入若虫期后表达量下降,且各龄若虫之间表达量相对平稳。Lm Omb基因在雌性和雄性成虫的胸部、足、腹部和翅中都有表达,且雌性和雄性之间表达量明显不同。【结论】LmOmb基因可能参与了飞蝗的胚胎发育。研究结果为进一步研究飞蝗LmOmb的功能提供了依据。     

Optimization of parental RNAi conditions for hunchback gene in Locusta migratoria manilensis (Meyen)

An investigation on the optimization of parental RNA interference (RNAi) conditionsfor hunchback {hb) gene in Locusta migratoria manilensis (Meyen) was conducted.Double stranded RNA (dsRNA) corresponding to hb gene was injected into haemocoel offemale adults of L.migratoria manilensis.Embryos developed from the eggs laid by theinjected adults on the 7th day after eclosion showed observable effects of RNAi for hb.Thesilencing effect after delivery treatment of dsRNA for hb gene was maintained for moretha...     

暗黑鳃金龟UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因的克隆、原核表达及功能分析

【目的】本研究旨在阐明暗黑鳃金龟Holotrichia parallela UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因HpUAP的序列特征和功能。【方法】通过PCR方法从暗黑鳃金龟2龄幼虫中扩增HpUAP全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;构建pET30a-HpUAP重组表达载体,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达;利用qRT-PCR检测HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段(1-3龄幼虫)和3龄第2天幼虫不同组织(体壁、中肠、直肠、回肠、马氏管和脂肪体)中的表达量。利用RNAi沉默暗黑鳃金龟2龄幼虫体内HpUAP基因后,观察其生长发育和存活情况,并测定RNAi 72 h后其HpUAP表达量和体壁几丁质含量。【结果】PCR扩增获得暗黑鳃金龟HpUAP 全长cDNA序列(GenBank登录号: MW676788),开放阅读框长1 461 bp,编码486个氨基酸残基,蛋白分子量约为53.9 kD。系统进化分析发现HpUAP与似牛嗡蜣螂Onthophagus taurinus UAP的氨基酸序列以较高的置信度聚为一个分支。经IPTG诱导可表达53.9 kD的HpUAP蛋白,与预期大小一致。发育表达谱结果表明HpUAP在1龄第1天和3龄第1天暗黑鳃金龟幼虫中表达量较高,组织表达谱结果表明HpUAP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫中肠和体壁中表达量较高。HpUAP RNAi导致暗黑鳃金龟2龄幼虫生长与行动缓慢,体表颜色加深并皱缩;RNAi处理72 h后,与对照组（dsGFP注射组）相比,dsHpUAP注射组HpUAP表达量下降了93.06%,死亡率增加了40%左右,表皮几丁质含量下降了约29%。【结论】结果说明HpUAP参与几丁质代谢,在暗黑鳃金龟幼虫的生长发育过程中起关键作用。     

东亚飞蝗UBX结构域包含蛋白基因 LmUBX2 的克隆和表达分析

【目的】UBX结构域包含蛋白是p97/CDC48的辅助因子。p97在泛素化相关的多种细胞过程中起着重要的作用,如依赖泛素 蛋白酶体系统的蛋白质降解和同型膜融合等。本研究旨在克隆东亚飞蝗 Locusta migratoria manilensis (Meyen)的UBX结构域包含蛋白基因,分析其组织和发育表达格局,为进一步研究UBX结构域包含蛋白基因的功能奠定基础。【方法】通过分析东亚飞蝗的转录组数据克隆UBX结构域包含蛋白基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在不同发育时期和成虫不同组织中的表达水平。【结果】克隆到东亚飞蝗的一个UBX结构域包含蛋白基因,命名为 LmUBX2。 LmUBX2 开放阅读框长1 020 bp,编码399个氨基酸,预测分子量和等电点分别为37.8 kDa和6.03,与其他UBX结构域包含蛋白的氨基酸一致性为37%~64%,N端和C端分别有一个保守的UBA结构域和UBX结构域。序列比较和系统发育分析发现 LmUBX2 属于SAKS1亚家族。定量分析发现,LmUBX2 在整个生命周期中都有表达,但成虫期的表达水平最高;在检测的所有组织中都有表达,但在精巢和卵巢中表达水平最高。【结论】研究结果说明 LmUBX2 可能参与东亚飞蝗多种生理过程,尤其可能与东亚飞蝗的生殖有关,但还需深入研究。     

Identification of LmUAP1 as a 20‐hydroxyecdysone response gene in the chitin biosynthesis pathway from the migratory locust,Locusta migratoria

In Locusta migratoria, we found that two chitin biosynthesis genes, UDP N‐acetylglucosamine pyrophosphorylase gene LmUAP1 and chitin synthase gene LmCHS1, are expressed mainly in the integument and are responsible for cuticle formation. However, whether these genes are regulated by 20‐hydroxyecdysone (20E) is still largely unclear. Here, we showed the developmental expression pattern of LmUAP1, LmCHS1 and the corresponding 20E titer during the last instar nymph stage of locust. RNA interference (RNAi) directed toward a common region of the two isoforms of LmEcR (LmEcRcom) reduced the expression level of LmUAP1, while there was no difference in the expression of LmCHS1. Meantime, injection of 20E in vivo induced the expression of LmUAP1 but not LmCHS1. Further, we found injection‐based RNAi of LmEcRcom resulted in 100% mortality. The locusts failed to molt with no apolysis, and maintained in the nymph stage until death. In conclusion, our preliminary results indicated that LmUAP1 in the chitin biosynthesis pathway is a 20E late‐response gene and LmEcR plays an essential role in locust growth and development, which could be a good potential target for RNAi‐based pest control.     

海藻糖酶基因TRE2-like和TRE2在异色瓢虫羽化过程中的表达与功能

【目的】异色瓢虫Harmonia axyridis是一种重要的捕食性天敌昆虫,海藻糖在异色瓢虫的变态发育、羽化等整个生命过程都起着重要的作用。本研究以前期获得的类似膜结合型海藻糖酶(TRE2-like)与膜结合型海藻糖酶(TRE2)基因为基础,探讨在异色瓢虫羽化阶段这两个海藻糖酶的潜在功能,为阐明异色瓢虫从蛹发育到成虫时海藻糖代谢机制提供参考。【方法】根据TRE2-like和TRE2基因序列设计双链RNA(dsRNA)区域片段并合成对应的dsRNA,通过RNAi将其注射到异色瓢虫2日龄蛹中。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫糖代谢相关基因的表达;同时采用蒽酮比色法、酶标法等分别测定RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫主要糖类物质含量及TRE活性变化,并观察异色瓢虫羽化后的表型变化。【结果】结果表明,与对照组(dsGFP注射组)相比,异色瓢虫2日龄蛹被注射TRE2-like或TRE2 dsRNA后,其新羽化成虫体内TRE2-like和TRE2表达量均极显著下调,且少数个体出现了蜕皮与翅形成困难等畸形表型。可溶性海藻糖酶活性在注射dsTRE2-like后显著降低,膜结合型海藻糖酶活性在注射dsTRE2后显著降低;注射dsTRE2后糖原含量显著下降,注射dsTRE2-like后糖原和海藻糖含量显著下降,注射dsTRE2-like+dsTRE2后糖原和葡萄糖含量显著下降,且海藻糖含量极显著下降。注射dsTRE2-like, dsTRE2和dsTRE2-like+dsTRE2后可溶性海藻糖酶基因TRE1-1和TRE1-2表达下降或显著下降,而TRE1-5表达上升或显著上升,海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase, TPS)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)、糖原合成酶(glycogen synthase, GS)基因的表达均显著下调。【结论】TRE2-like和TRE2基因表达被抑制后,异色瓢虫海藻糖等代谢受到影响。研究结果为探究异色瓢虫体内膜结合型海藻糖酶的潜在功能和调控机制奠定了基础。