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共有20条相似文献,以下是第1-20项 搜索用时 343 毫秒

1.  Q20L及G247D定点突变对葡萄糖异构酶酶活和最适pH的改善  
   朱国萍 罗丹 蔡云飞 朱学勇 滕脉坤 王玉珍《生物工程学报》,2000年第16卷第4期
   用双引物法对GI基因进行体外定点突变,构建了突变体Q20L和G247D。含突变基因的重组表达质粒pTKD-GIQ20L及pTKDGIG247D在E.coli K38菌株中表达。纯化的突变酶与野生型酶相比:(1) GIQ20L的最适反应温度下降5℃,热稳定性为野生型酶的78%,对底物的亲和性增强;(2) GIG247D的酶活提高约33%,最适pH下降0.6个单位,但热稳定性降低。初步分析认为,Gln 20位于α0~α1螺旋之间,其亲水侧链被Leu的疏水侧链取代后,分子表面增强的疏水作用,反而不利于蛋白质的稳定,使GIQ20L的热稳定性降低。Gly247是酶活性中心β折叠(242~247aa)的最后一个残基。引入电负性极强的Asp后,可能改变分子的静电场分布,影响了活性部位的电荷传递过程,使GIG247D酶活提高。引入的电荷,可能改变活性中心可解离基团的pKa,使其最适pH下降。另外Asp247的侧链在周围空间结构中显得过于拥挤,易与其他侧链产生排斥,由此影响到β-折叠的稳定性,接近亚基结合面的Asp247,可能进一步影响到亚基间相互作用的稳定性,最终导致酶热稳定性的降低。GI酶活和最适pH的改善更利于工业生产。    

2.  K253R和N184V点突变对葡萄糖异构酶热稳定性的影响  被引次数:3
   伍传金 肖亚中《生物化学与生物物理学报》,1996年第28卷第3期
   用人工合成的寡核苷酸突变引物,以双引物法于重组M13mp19载体上进行定点突变,分别得到了葡萄糖异构酶的突变体GIK253R和GIN184V。测定它们的热稳定性,并将之与野生型酶比较,结果表明:(1)GIK253R于70℃、80℃下的热稳定性小于野生型,但在70℃、1mol/LL-鼠李糖中,两者的失活速度相近。另外;GIK253R的比活是野生型的1.5倍。(2)GIN184V的比活和热稳定性都远低于野生型,Asn184为酶活性中心构象的维持所必需.本文还根据动力学数据和分子结构模型对以上结果作了初步分析.    

3.  用蛋白质工程方法改变葡萄糖异构酶最适pH和最适温度  被引次数:5
   肖亚中 伍传金《生物化学与生物物理学报》,1995年第27卷第5期
   用寡核苷酸诱导的定点突变方法构建了葡萄糖异构酶基因的突变体(N184D和A198C)。含突变体的重组质粒pTKD-GI1(N184D)和pTKD-GI2(A198c)在E.coliK38菌株中表达,用DEAE-Sepharose FF和Sephacryl S-300HR柱层析分离纯化突变酶。与野生型葡萄糖异构酶比较实验表明:(1)突变酶N184D的最适pH值下降了1个单位;等电点下降了0.6个单位    

4.  葡萄糖异构酶突变体酶GIGl38P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测  被引次数:1
   朱国萍  张颖  徐旸  唐建国  徐冲《生物工程学报》,2002年第18卷第3期
   将含有G138P单点突变和G138P-G247D双点突变的GI结构基因,分别克隆入E.coli-链霉菌穿梭载体pHZ-1272,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化,将穿梭表达载体异入变铅青链霉菌TK54菌株。30℃振荡培养24h,加入2μg/mL硫链丝菌素诱导表达12h。SDS-PAGE电泳表明,两个穿梭载体在TK54菌株内表达出42.5kD特异性条带。薄层扫描显示,突变体酶GIG138P和GIG138P-G247D分别约占可溶性蛋白的19%和22%。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌TK54中获得了表达。    

5.  GI双突变体GIK253RA198C的构建及其性质分析  
   伍传金  王琛  滕脉坤  王淳  肖亚中  王玉珍  牛立文  崔涛《生物化学与生物物理进展》,1997年第24卷第6期
   以双引物法对葡萄糖异构酶(GI)基因进行定点突变,将突变体基因于大肠杆菌中表达,获得了GI双点突变体GIK253RA198C.研究K253R和A198C双点突变对GI的结构和性质的作用,结果表明GIK253RA198C的热稳定性明显下降,最适反应温度降低5℃.文章从结构和机制上解释了为何同是K253R突变,对SM33 GI和密苏里游动放线菌GI的热稳定性产生不同的影响,认为这是由于Lys253在两种GI结构的位置上存在微小差异,从而使引入的Arg对亚基间的相互作用产生了相反效应所引起.    

6.  P197E与ep8叠加突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的影响  被引次数:1
   刘燕雅  黄平  司圣乾  陈彦  林琳《微生物学通报》,2010年第37卷第2期
   为提高脂肪酶的热稳定性, 作者利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶(PEL)基因进行了体外定点突变, 构建了P197E (即将第197位的脯氨酸突变为谷氨酸)与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pPIC3.5K-ep8-P197E。将该质粒电转化至毕赤酵母Pichia pastoris GS115中, 进行异源表达。与野生型酶和单点突变酶PEL-ep8的酶学性质比较, 结果表明: 叠加突变体PEL-ep8-P197E在40°C温育处理30 min后, 残余酶活分别比野生型PEL和随机突变体PEL-ep8提高了42.13%和37.3%。叠加突变体PEL-ep8-P197E的Tm值为41.51°C, 比野生型酶PEL提高了2.81°C, 比随机突变体脂肪酶PEL-ep8提高了2.25°C。通过对脂肪酶PEL的叠加突变, 提高了该酶的热稳定性, 并为结构与功能的进一步研究提供了材料。    

7.  49P(del)点突变提高中性纤维素内切酶EGV热稳定性的初步研究  
   方芳  曹以诚  陈晓曦  曾炳佳《生物磁学》,2009年第14期
   目的:探讨利用点突变方法改善EGV热稳定性的可能性和有效性。方法:对来源于Melanocarpus albomyces endoglucanase的耐热性纤维素酶maEG进行同源建模和序列比较,删除49位脯氨酸49P(del)进行定点突变,并将得到的突变体在毕氏酵母X33中表达,对表达产物进行酶活性和热稳定性检测。结果:突变酶49P(del)在70℃处理120min,热稳定性比EGV提高了21.6%,且突变酶其他性质与野生型酶基本相似。结论:通过对中性纤维素内切酶EGV的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为进一步研究其结构和功能提供了材料。结果同时表明利用生物信息学和分子模拟技术,缩短表面环区对于酶的热稳定性有一定的作用。    

8.  单点突变葡萄糖异构酶(GIG138P)基因在变铅青链霉菌中的高效表达及其稳定性研究  被引次数:1
   杨永辉  徐冲  廖军  周慧毓  朱国萍  牛立文  王玉珍《中国生物化学与分子生物学报》,2000年第16卷第1期
    通过三步亚克隆 ,将单点突变葡萄糖异构酶 ( GIG1 38P)基因及其调控序列插入链霉菌质粒p IJ40 83,构建重组表达质粒 p IJ40 83- GI1 .用重组质粒转化变铅青链霉菌 TK54原生质体 ,经硫链丝菌素抗性 ( Th R)筛选 ,获得重组菌株 TK54/p IJ40 83- GI1 .酶活力测定和 SDS- PAGE分析表明 ,GIG1 38P基因在变铅青链霉菌中得到高效表达 ,GI1粗酶液比活力为 1 5U/mg,GI1表达量约占菌体可溶性蛋白的 2 5% .同时也研究了重组质粒的遗传稳定性 .重组菌株在无选择压力条件下经液体连续传代培养 ,GI1比活力和 GI1表达量在 2 0 0 h传代时间中呈平缓下降趋势    

9.  N13D、S40E点突变提高木聚糖酶XYNB的热稳定性  被引次数:1
   杨浩萌  王亚茹  伍宁丰  姚斌《微生物学通报》,2007年第34卷第3期
   对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性比XYNB分别提高了24.76%和14.46%;突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22%。在其他性质方面突变酶N13D、S40E与野生型酶XYNB基本相似。通过对木聚糖酶XYNB的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。    

10.  葡萄糖异构酶突变体酶GIG138P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测  
   朱国萍 张颖 徐旸 唐建国 徐冲《生物工程学报》,2002年第18卷第3期
   将含有G138P单点突变和G138P-G247D双点突变的GI结构基因,分别克隆入E.coli链霉菌穿梭载体pHZ1272,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化,将穿梭表达载体导入变铅青链霉菌TK54菌株。30℃振荡培养24h,加入2 μg/mL 硫链丝菌素诱导表达12h。SDSPAGE电泳表明,两个穿梭载体在TK54菌株内表达出425 kD特异性条带。薄层扫描显示,突变体酶GIG138P和GIG138PG247D分别约占可溶性蛋白的19%和22%。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138PG247D在变铅青链霉菌TK54中获得了表达。    

11.  葡萄糖异构酶基因工程菌的改造初探  
   徐冲  左军  廖军  杨永辉  陶丽梅  朱国萍  伍传金  滕脉坤  王玉珍《中国生物化学与分子生物学报》,1999年第15卷第4期
   葡萄糖异构酶(glucoseisomerase,GI)是使用量最大的工业酶之一,可用于高果糖浆的生产,也可以用含木聚糖物质及废料为底物发酵生产乙醇,具有重要的经济价值.本文选择了表达载体pBV220[1],利用PCR方法删除了原表达质粒pTKDGI1中GI结构基因5′端多余的核苷酸,并添加了合适的酶切位点,重新构建了能在大肠杆菌DH5α中高效表达GIG138P的表达质粒pBZGI1.传代实验表明,新表达体系的稳定性明显优于原表达体系.粗酶液经热处理、DEAESepharoseFF和分子筛Se…    

12.  变性双链法实现葡萄糖异构酶基因敲除的研究  
   廖军  徐冲  杨永辉  李晖  程阳  陈承露  朱国萍  牛立文  王玉珍《遗传学报》,2000年第27卷第5期
   对7号淀粉酶菌M1033的遗传背景进行分析,建立了其原生质体制备、转化的优化条件。构建了葡萄糖异构酶(GI)结构基因内插千方百计以链丝菌肽基因(tsr)的置换型同源重组质粒,利用其变性双链片段实现与M1033菌株染色体上基因的同源重组,获得置换型葡萄异构酶缺陷型蓖M1033LJ。为在染色体上引入突变位点实现染色体上分子定点改造造尊定了基础。    

13.  扩展青霉脂肪酶ep8与R182K叠加突变体的构建  
   王彩梅  蔡少丽  吴义真  林琳《生物技术通报》,2007年第4期
   利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并将含突变基因的重组质粒pAO815-ep8-R182K在毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中进行表达。叠加突变体PEL-ep8-R182K表达产物与野生型PEL、PEL-ep8比较实验表明:叠加突变体表达蛋白PEL-ep8-R182K最适反应温度与野生型PEL、PEL-ep8一致,均为40℃;热稳定性与野生型相似,比PEL-ep8降低2.25℃。但是,在比活上,PEL-ep8-R182K与PEL-ep8、野生型PEL相比,其比酶活分别提高了14.03%和3.86%。    

14.  扩展青霉脂肪酶K56R叠加突变对热稳定性的影响  被引次数:1
   沈麟  施文芳  胡长浩  林琳《生物技术》,2009年第19卷第2期
   目的:扩展青霉脂肪酶随机突变体ep8是一株热稳定性比野生型有所提高的突变体.获得热稳定性提高的优良菌株.方法:在ep8的基础上利用重叠延伸PCR构建叠加突变重组质粒pPIC3.5K-ep8一K56R,将该质粒电转毕赤酵母(Pichia paaoris)GS115进行异源表达.结果:该叠加突变脂肪酶在毕赤酵母中获得了活性表达.15%SDS-PACE结果分析表明突变脂肪酶PEL-ep8-K56R-GS分子量与野生型PEL-GS一致,约为28kDa.叠加突变脂肪酶在37℃时酶活为852U/mL、野生型为760u/mL、随机突变体为824u/mL,叠加突变体酶活相比野生型提高了21.1%,相比随机突变体提高了3.4%.热稳定性分析数据表明叠加突变脂肪酶Tm值为40.1℃、野生型为38.7℃、随机突变体为39.9℃,Tm值相比野生型提高了1.4℃,相比随机突变体提高了0.2℃.    

15.  黄翅大白蚁来源β-葡萄糖苷酶的分子改造  
   姜淑喆  李净净  曹春静  申玉龙  倪金凤《生物工程学报》,2018年第7期
   纤维素水解成为葡萄糖需要一系列纤维素酶的作用,其中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)起着至关重要的作用。来自于培菌白蚁中肠的β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)具有较高的葡萄糖耐受性(1.5 mol/L的葡萄糖,保持60%以上的酶活力),但是,酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)在食品以及工业领域中的应用。因此通过对保守氨基酸附近的非保守氨基酸定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比MbmgBG1分别高出约2倍和4倍。突变体的K_(cat)/K_m值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比MbmgBG1强。当酶活力保留60%以上时,MbmgBG1所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L,而F167L为2.0 mol/L,R354K为3.0 mol/L。这些特性的增强表明,对活性中心附近保守区域内的非保守氨基酸突变,可以较大程度地影响活性,因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位点,进行改造以提高催化效率。    

16.  应用易错PCR技术提高环糊精葡萄糖基转移酶的可溶性表达  
   郭永华  陈济琛  贾宪波  陈龙军  蔡海松  林新坚《微生物学报》,2016年第56卷第10期
   [目的]对嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)基因进行定向进化,筛选得到胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变酶。[方法]采用易错PCR技术向环糊精葡萄糖基转移酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。[结果]通过筛选获得CGTase胞外酶活性和可溶性表达定量提高的突变菌株ds-6和ep-9,其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍,可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明,突变体ep-9有3个碱基发生了变化:G2005A/A2037G/T2081G,其中有2个碱基突变导致了氨基酸的改变。SWISS-MODEL数据库模拟CGTase的结构表明,2个突变氨基酸分别位于无规卷曲和β-转角/折叠之间的转角中。酶学性质测定表明:突变CGTase的β-环化比活力是原始酶的2.44倍,总环化比活力提高了34%,Km值由4.3 g/L降低到3.74 g/L;在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是G2005A。[结论]本试验表明:基于易错PCR技术获得嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase的胞外酶活和可溶性表达定向进化,G2005A突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用,这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义。    

17.  7号淀粉酶链霉菌M1033菌株葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的高效表达  
   崔虹   刘咸安   李澄清   伍传金   王玉珍   王淳   牛立文   徐洵   崔涛  《生物工程学报》,1996年第12卷第Z1期
   从已克隆的含7号淀粉酶链霉菌M1033菌株产葡萄糖异构酶基因的质粒pUB中,用DdeI和Kpnl酶解,分离出酶结构基因,以平端方式与大肠杆菌质粒pT7-7连接,构建了重组表达质粒pTKD-GI。将pTKD-GI转化到特异大肠杆菌寄主K38,经42℃热诱导,所产葡萄糖异构酶占菌体可溶性蛋白35%。通过DEAE-A50柱和G-150柱层析,发酵液可获电泳纯蛋白34mg/L。    

18.  D92P点突变对扩展青霉碱性脂肪酶最适作用温度的改善  被引次数:2
   陈木妹  林琳《生物技术通讯》,2005年第16卷第1期
   利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3.5K—lip-D92P。将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达。与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PELD92P—GS最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性与野生型相当;突变体在40℃下的表达量为109U/mL,约为野生型的29%。结果分析表明,Pro替代Asp^92后,可能是由于Pro一级结构的特点,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合。    

19.  重组具有改良特性的D-氨基酸氧化酶  
   S.V Khoronenkov  V.I.Tishkov《生物工程学报》,2008年第24卷第12期
   在大肠杆菌细胞中表达三角酵母D-氨基酸氧化酶, 并对重组酶的性质进行了研究。制备的单一突变体与野生型酶相比, 具有2.4倍的热稳定性或底物特异性变化光谱。结果显示突变的TvDAAO在氧化头孢菌素中催化效果优于野生型酶。并将一个突变的重组TvDAAO制备成结晶, 并解析了2.8 ?分辨率下的晶体结构。    

20.  Thermus thermophilus HB8葡萄糖异构酶在大肠杆菌中表达  被引次数:1
   丁莉  许伟  严明  许琳《生物加工过程》,2006年第4卷第2期
   为了增加高热稳定性的葡萄糖异构酶的得率,采用PCR技术扩增得到Thermus thermophilusHB8葡萄糖异构酶基因xylA,连接到表达载体pET-22b( )上,获得重组质粒pET-22b( )-xylA。将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测葡萄糖异构酶酶活。重组菌经诱导培养,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子量约为44 kD特异性蛋白质条带,比酶活约为18.562 U/mg,比野生型菌株提高了2倍。    

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