利用CRISPR/Cas9系统构建FGF21基因敲除小鼠模型

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)是细胞间的多功能信号分子,调节生物体的多种生理功能。FGF21作为一种重要的调控因子,对毛囊发育及生长周期具有重要作用。为研究FGF21基因对毛囊发育及生长周期的影响及作用机制,本研究通过构建靶向敲除FGF21基因的载体,体外将Cas9 mRNA和gRNA显微注射到FVB小鼠受精卵中,在小鼠FGF21基因的第1外显子上造成移码突变,从而获得FGF21基因敲除(knock out, KO)小鼠。通过测序鉴定F₀代小鼠基因型,共获得3只FGF21等位基因敲除小鼠(Fgf21 ^-/-);qRT-PCR和Western blotting结果表明,在Fgf21 ^-/-小鼠中未检测到FGF21 mRNA表达和FGF21蛋白表达;经脱毛再生及皮肤组织H&E染色发现,与野生型(wild type, WT)小鼠相比,Fgf21 ^-/-小鼠体重降低、器官组织未出现异常变化、毛发生长速度减慢、毛囊的直径和毛发的密度均减小。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Fgf21 ^-/-小鼠模型,为后续研究FGF21基因在毛囊发育及生长周期中的功能提供了更好的动物模型。     

Pd-1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的:细胞程序性死亡蛋白(programmed death ligand-1,PD-1)是机体T细胞的免疫检查点,也是肿瘤治疗的重要靶点。采用CRISPR/Cas9技术,利用非同源重组修复引入突变的方式,使基因蛋白读码框移码造成PD-1功能缺失,建立Pd-1基因敲除小鼠模型,为深入探究Pd-1基因功能及作用机制提供基础。方法:针对Pd-1基因2-4号外显子设计并合成2对sgRNA片段,与编码Cas9片段共同体外转录,通过受精卵显微注射方法将两者mRNA混合注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经PCR产物测序鉴定获得F0代小鼠,之后与野生型C57BL/6小鼠交配获得F1代杂合子小鼠,F1代小鼠自交即获得F2代纯合子小鼠品系(Pd-1^-/-)。刀豆蛋白(concanavalin A,ConA)刺激Pd-1^-/-小鼠后,通过实时荧光定量PCR和流式细胞技术在mRNA和蛋白水平上分别检测Pd-1^-/-小鼠中Pd-1基因在转录和翻译过程中的表达情况,并通过ELISA方法检测Pd-1^-/-小鼠血清中IL-6、IFN-γ、IL12/IL23及TNF-α等因子的表达水平,初步分析Pd-1通路在T细胞反应调控中的作用机制及对免疫刺激的响应情况。结果:PCR及测序结果表明在小鼠基因组中Pd-1基因2-4号外显子被成功敲除;Real-Time PCR实验和流式检测结果显示:与野生型小鼠相比,Pd-1^-/-小鼠脾、肠系膜淋巴结、胸腺和血液各组织中Pd-1表达水平均显著降低;双抗夹心ELISA测定结果显示:Pd-1敲除后经ConA刺激,血清中IL-6和IFN-γ表达上调。结论:成功构建Pd-1基因敲除小鼠模型。Pd-1缺失能够上调IL-6和IFN-γ对ConA刺激的响应,增加ConA引起的炎症反应,为Pd-1的体内基因功能研究提供了新的小鼠模型和研究思路。     

Synaptotagmin 1基因敲除对小鼠行为的影响*

目的: 研究Synaptotagmin 1基因敲除(Syt1^+/-)对小鼠情绪行为的影响并初步探讨其可能机制。方法: 选取8周龄雄性Syt1^+/-小鼠及同窝野生型(WT)小鼠各5只,采用免疫荧光染色方法观察小鼠前额叶皮层、海马、杏仁核、伏隔核、纹状体和腹侧被盖区等6个脑区中Syt1的表达;选用8周龄雄性Syt1^+/-小鼠9只,以及WT小鼠10只为对照,通过旷场实验、高架十字迷宫实验和强迫游泳实验检测比较成年Syt1^+/-小鼠和WT小鼠的焦虑样行为;另选用8周龄雄性Syt1^+/-小鼠及WT小鼠各5只,检测小鼠前额叶皮层、海马和杏仁核的谷氨酸含量。结果: 与WT小鼠相比,Syt1^+/-小鼠在前额叶皮层、海马、杏仁核、伏隔核、纹状体和腹侧被盖区Syt1阳性细胞数目显著减少(P＜0.01);Syt1^+/-小鼠在旷场中总移动距离显著减少(P＜0.01),并更偏爱在外周区域活动(P＜0.01),对中心区域的探索欲望显著下降(P＜0.01);Syt1^+/-小鼠更偏好待在封闭安全环境中(P＜0.01),开臂探索次数(P＜0.05)和在其中运动的时间显著减少(P＜0.01);Syt1^+/-小鼠在强迫游泳实验中不动时间明显增加(P＜0.01);同时,Syt1^+/-小鼠杏仁核中谷氨酸的含量显著增加(P＜0.01)。结论: Syt1基因敲除可以引起小鼠显著的焦虑样行为,推测与杏仁核中谷氨酸含量增加有关。     

PD-L1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的 程序性死亡配体-1(PD-L1)是免疫调节途径的重要因子,是抗肿瘤免疫疗法中重要的靶标之一。利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法 构建Cas9和sgRNA载体,并转录获得RNA,通过显微注射方式将RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经过鉴定获得F₀代阳性小鼠。F₀代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配获得F₁代杂合子小鼠,再通过F₁代小鼠自交获得F₂代纯合子小鼠品系。随后通过Real-Time PCR和流式实验分别检测PD-L1基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果 Real-Time PCR和流式实验检测结果显示与野生型C57小鼠相比,PD-L1纯合子小鼠的PD-L1 mRNA相对表达水平和细胞上的蛋白质表达均有显著性下降,仅测定到本底的信号,证实已成功构建PD-L1基因敲除小鼠品系,为PD-L1体内基因功能研究提供了新的小鼠模型。     

Ash2l-1/Ash2l-2在小鼠胚胎干细胞中的表达特异性及互补效应

H3K4me3是一种重要的表观遗传修饰,主要由MLL(mixed lineage leukemia)甲基转移酶复合体催化,对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)自我更新能力的维持具有重要作用。ASH2L是MLL复合体中一个重要的核心亚单位,参与调控mESCs中染色质的开放状态。ASH2L在mESCs中有2个异构体：ASH2L-1(80 kDa)和ASH2L-2(65 kDa),且以ASH2L-2的表达为主;而在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)中,只有ASH2L-1表达。目前,Ash2l-1和Ash2l-2在mESCs中的作用尚不清楚。本文利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,建立了Ash2l-1 ^-/-和Ash2l-2 ^-/-mESCs。通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和qRT-PCR发现,Ash2l-1 ^-/-和Ash2l-2 ^-/-mESCs在碱性磷酸酶、多能性调控转录因子(Oct4、Nanog、Sox2和Klf4)的表达与野生型对照无显著差异。通过拟胚体分化实验,发现Ash2l-1 ^-/-mESCs诱导的拟胚体在Snai2(外胚层标记基因)和Gata4(内胚层标记基因)的表达上显著低于野生型mESCs诱导的拟胚体(P<0.01)。通过Western blotting,发现Ash2l-1 ^-/-mESCs中ASH2L-2的表达显著上调(P<0.01),Ash2l-2 ^-/-mESCs中ASH2L-1的表达显著上调(P<0.01),而Ash2l-1 ^-/-和Ash2l-2 ^-/-mESCs中,基因组H3K4me3的表达与野生型对照并无显著差异。这表明Ash2l-1和Ash2l-2之间存在补偿效应。利用JASPAR和KEGG预测分析发现,Ash2l-1和Ash2l-2启动子区分别具有3个和16个潜在的多能性转录因子结合位点,这些转录因子可能介导实现Ash2l-1和Ash2l-2之间的补偿效应。以上结果表明,Ash2l-1和Ash2l-2之间的补偿效应可能参与mESCs多能性的维持和基因组H3K4me3的调控。     

胸腺上皮细胞特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型的鉴定及免疫学特征观察

目的 构建并鉴定胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells, TECs)特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型,评价其免疫学特征。方法 采用小鼠胚胎干细胞(ES细胞,embryonic stem cells)打靶基因敲除技术,得到F0代的GSK-3β^flox/flox(GSK-3β^f/f)小鼠;再采用Cre-LoxP系统进行小鼠的繁殖;PCR鉴定,筛选出基因型为GSK-3β^f/fFoxN1-Cre^+/-(GSK-3β^-/-)小鼠,即为在TECs特异性敲除GSK-3β基因的小鼠。观察基因敲除鼠的一般生物学特征、繁殖能力和子代存活率。应用HE染色、流式细胞术及免疫荧光技术,比较基因敲除鼠和野生型小鼠免疫器官结构、胸腺、脾及外周血中免疫细胞比例及增殖能力差异。结果 成功构建TECs特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型。与野生型(wild type, WT)小鼠相比,GSK-3β^-/-小鼠一般生物学特征无明显差异,子代存活率> 90%;衰老进程中...     

AUF1在胞质DNA抑制细胞葡萄糖代谢中的作用研究

目的 探讨AUF1在胞质DNA引起的细胞葡萄糖代谢应答中的作用及其机制。方法 (1)用核质分离技术分离细胞核与细胞质,并通过生物素-亲和素亲和层析技术分离细胞质中与胞质DNA(ISD)结合的蛋白质,然后通过“银染-质谱”和“复合物-质谱”技术鉴定出差异蛋白——AUF1。再利用体外结合实验验证AUF1与胞质DNA的相互作用。(2)在胞质DNA刺激后,通过ATP检测试剂盒和CCK8细胞氧还活力检测试剂,比较野生型细胞和基于CRISPR/Cas9技术的AUF1基因敲除细胞中葡萄糖代谢应答情况。(3)通过半定量PCR技术,在野生型、基因敲除AUF1、基因敲除后回补AUF1或空载体的四类细胞中检测葡萄糖转运蛋白GLUTs以及葡萄糖代谢相关酶的mRNA表达情况,筛选出与细胞糖代谢相关的AUF1下游效应分子——GLUT3。进而用实时荧光定量PCR进行验证。(4)通过半定量和荧光定量PCR分析胞质DNA刺激下GLUT3的mRNA变化情况,分析胞质DNA的刺激是否影响GLUT3的mRNA表达。结果 (1)两次质谱分析均发现AUF1能与ISD结合。体外结合实验也证实,不论是原核表达的GST-AUF1还是真核细胞表达的GFP-AUF1均能与单链和双链的ISD相结合。(2)基因敲除AUF1后的HEK293细胞在用胞质DNA刺激后,胞内的ATP水平和对CCK8的还原能力都明显高于野生型细胞。提示AUF1基因敲除细胞内的葡萄糖代谢不受胞质DNA刺激所抑制,说明AUF1很可能参与了胞质DNA对细胞糖代谢的调节。(3)半定量PCR技术检测发现在AUF1敲除的细胞中GLUT3的mRNA明显减少,而其他的GLUT家族成员和代谢酶则没有显著差异。实时荧光定量PCR证实上述现象,提示AUF1很可能通过稳定GLUT3的mRNA参与葡萄糖代谢的调节。(4)无论是单链还是双链ISD刺激后的细胞中,GLUT3的mRNA均减少,说明GLUT3可能是胞质DNA对糖代谢的调节过程中的一个下游效应分子。结论 AUF1能与胞质DNA结合,很可能通过调节下游GLUT3的mRNA稳定性参与胞质DNA引起的糖代谢应答反应。     

肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)敲除和人源化小鼠模型的建立

目的建立肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)基因人源化小鼠模型,同时建立TNFRSF4基因敲除小鼠模型,为针对TNFRSF4靶点的肿瘤治疗性抗体研发和筛选提供有效的小鼠模型,并为研究TNFRSF4在免疫过程中的作用机制提供小鼠模型。方法利用CRISPR/Cas9技术,建立TNFRSF4基因人源化和敲除小鼠模型,利用PCR、RT-PCR、免疫组织化学、流式细胞术等方法鉴定及比较分析人源化小鼠、敲除小鼠和野生型小鼠的差异。结果获得表达人源TNFRSF4基因小鼠和TNFRSF4基因敲除小鼠。在TNFRSF4人源化小鼠中稳定表达人源TNFRSF4,未检测到小鼠TNFRSF4表达。在TNFRSF4敲除小鼠中未检测到TNFRSF4表达。TNFRSF4人源化及敲除小鼠出生后6个月内均正常存活,组织病理学表型及免疫系统未见明显异常。结论利用CRISPR/Cas9技术构建TNFRSF4人源化小鼠及敲除小鼠,可用于筛选及评估与TNFRSF4基因相关的治疗性抗体及药物或研究TNFRSF4在免疫过程中作用机制。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

通过高效基因编辑技术构建小鼠 Rnf148 基因敲除模型

众所周知,利用同源重组原理,对DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)引起的基因损伤进行修复是早期研究人员用于制造基因突变小鼠的方法之一(Capecchi,1989)。但由于其效率低以及消耗时间过长而被锌指核糖核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)所取代(Bibikova et al.,2002;Moscou and Bogdanove,2009)。然而,ZFNs和TALENs也并非最优基因修饰技术,两者因其步骤复杂和细胞毒性,运用受到限制。近年来,已逐步被一种新基因编辑技术CRISPR/Cas9所代替。CRISPR/Cas9最初起源于细菌的自我防御系统,是近年运用于细胞和动物模型基因改造的主要方法,可以快速而高效获得基因敲除模型。泛素化系统是机体维持正常生物功能的蛋白降解系统,也是近年的研究热点,睾丸特异表达基因Rnf148是泛素化连接酶家族成员之一。为此,我们运用cas9技术构建小鼠Rnf148基因敲除模型,以进一步研究其在小鼠生精过程中的作用。通过针对Rnf148基因外显子设计特异的sg RNA(short guide RNA),与Cas9 m RNA共显微注射小鼠受精卵,我们成功获得了Rnf148的F0代敲除小鼠,将其与野生型小鼠交配,进一步成功获得了纯合Rnf148基因敲除小鼠。因此,利用cas9技术确实可以获得基因敲除鼠用于后续研究。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

斑马鱼tbx2b调控心脏房室间隔发育的功能研究*

tbx2是早期心脏发育的关键基因。为进一步探究其对房室间隔(AVC)发育的影响,研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,成功构建了斑马鱼tbx2b突变体。通过T7E1酶切对其F₀进行敲除效率检测,结果显示平均敲除效率约为57.5%。F₁进一步筛选获得tbx2b杂合突变体,测序结果显示突变类型为11 bp碱基缺失的移码突变。tbx2b杂合子内交获得纯合子,tbx2b纯合突变体在5 dpf死亡并出现早期心脏环化异常表型。斑马鱼整胚原位杂交实验显示在3 dpf tbx2b纯合突变体中, 心脏腔室分化特异性标志基因nppa、nppb表达上调并异位表达在AVC,而AVC发育关键基因has2的表达消失。高效构建tbx2b突变体并初探其对下游基因的影响,为后续深入研究tbx2b对心脏AVC发育的作用奠定了基础,同时加深了人们对早期心脏调控网络的认识。     

果蝇睾丸基因敲除突变体的构建及表型分析

生殖系统功能的正常维持是物种繁衍的基础,需要多基因协同作用,但其中许多基因的具体功能和作用机制并不清楚。本研究选取了果蝇(Drosophila melanogaster)中8个在睾丸中表达、功能未知且与人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)高度同源的基因(CG4161、CG11475、CG2921、CG10541、CG7276、CG3800、CG8117和CG16779),分析了它们在不同组织中的表达水平,并分别检测了它们在雄性生殖系统中的功能。在这8个基因中,前5个为睾丸优势表达基因,其余3个为全身性表达。首先,利用CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技术结合同源定向修复(homology-directed repair, HDR)在果蝇中对8个候选基因逐一进行敲除,建立了纯合的基因敲除突变品系;然后对这些品系的雄蝇进行了生育力测试及睾丸细胞学观察。结果显示,CG7276和CG3800基因敲除果蝇出现部分雄蝇不育且可育雄蝇后代数量较野生型显著下降。睾丸解剖观察显示CG7276和CG3800的功能缺失可导致雄蝇分别出现不同程度的精囊缩小及精原干细胞减少和细胞分布混乱;染色结果也提示CG7276和CG3800在精子的成熟过程中发挥一定作用。其他6个基因突变并未导致雄蝇育性变化或睾丸形态异常。这些突变体的获得及表型的初步分析为进一步研究基因功能及机制提供了良好的动物模型及基础。     

CRISPR/Cas系统与志贺菌毒力和耐药的关系及插入序列IS600对cse2表达水平的影响北大核心CSCD

【目的】了解志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布及其与毒力和耐药的关系,并分析志贺菌中插入序列IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【方法】利用课题组前期设计的引物PCR扩增志贺菌的3个CRISPR位点、CRISPR相关蛋白基因cse2、耐药基因和毒力基因;改良Kirby-Bauer(K-B)纸片法进行药敏试验;台盼蓝计数试验检测细菌毒力;Real-time PCR检测志贺菌中cse2基因m RNA表达水平。分别分析志贺菌中CRISPR/Cas系统与耐药基因、耐药表型、毒力基因、毒力表型的关系;了解IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【结果】志贺菌中CRISPR1位点阴性细菌的毒力强;插入序列IS600使cse2 m RNA表达水平降低。【结论】志贺菌中存在CRISPR1、2、3位点;CRISPR1位点与毒力有关;插入序列IS600对cse2 m RNA表达水平有影响。