薄层色谱和高效液相色谱联用测定暗纹东方鲀肌肉中肌肽和谷胱甘肽的含量

通过薄层色谱(TLC)与高效液相色谱(HPLC)联用技术鉴定了暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)肌肉中存在肌肽和谷胱甘肽,同时利用高效液相色谱法测定了肌肽和谷胱甘肽(GSH)的含量。薄层层析采用的展开剂为正丁醇:乙酸:水(4∶2∶1),层析板为硅胶板。高效液相色谱利用Kromasil C18反相柱分析,流动相为10%的纯乙腈和90%含有0.05%三氟乙酸的超纯水。结果表明:通过薄层色谱和高效液相色谱鉴定了暗纹东方鲀肌肉中肌肽和谷胱甘肽,其中暗纹东方鲀肌肉中肌肽含量约213μg/g(鲜重),还原性谷胱甘肽含量约211μg/g(鲜重)。本法样品无需衍生,操作简便,适合于暗纹东方鲀肌肉中肌肽和谷胱甘肽的测定。本文为生物体内肌肽和谷胱甘肽的研究提供借鉴意义。     

饲料中添加壳聚糖和益生菌对暗纹东方纯幼鱼生长及部分消化酶活性的影响

在基础饲料中分别添加不同浓度的益生菌(0.1%、0.2%、0.4%)、壳聚糖(0.2%、0.5%、1.0%)、壳聚糖与益生菌混合物、甘露聚糖与益生菌混合物,在室内水泥池(5.0m×2.0m×1.0m)中喂养暗纹东方鲀幼鱼(3.15±0.05g),用基础饲料投喂暗纹东方鲀作为对照,每组三个重复,60d后测定鱼体的生长、肌肉生化成分、肝胰脏、肠道蛋白酶和淀粉酶活性和白肌RNA/DNA。结果显示,对照组相对增重率为476.4%,饲料中添加0.2%的壳聚糖、0.1%的益生菌对暗纹东方鲀的促生长作用最明显,相对增重率显著提高。壳聚糖与益生菌混合物、甘露聚糖与益生菌混合物对生长无显著影响。对照组肌肉蛋白质和脂肪含量分别为82.94%、11.21%,壳聚糖、益生菌与甘露聚糖在饲料中的添加,能够显著降低肌肉脂肪含量,显著提高肌肉蛋白质含量,也能在一定程度上降低肝体比。0.2%壳聚糖和0.1%益生菌能使肠道淀粉酶活性显著增强(P<0.05),白肌RNA/DNA显著增大(P<0.05),说明肠道淀粉酶活性增强和蛋白质合成增加是壳聚糖和益生菌促进暗纹东方鲀生长的重要原因。     

暗纹东方鲀线粒体COI及其侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

以暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)肝脏的线粒体DNA为模板,按照红鳍东方鲀线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,克隆并测定了线粒体细胞色素氧化酶I亚基（COI）及其侧翼tRNA基因的全序列,结果显示,克隆了暗纹东方鲀COI基因1546bp及其5′端上游的tRNATyr基因和3′端下游的tRNASer基因序列共1766bp。用DNA分析软件对暗纹东方鲀与GenBank中10个目13种鱼类的COI序列进行比较分析,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的COI基因具有较高的同源性,与同属红鳍东方鲀的同源性最高为97.6%,与同目不同科的矛尾翻车鲀和翻车鲀的同源性为76.5%和75.4%。根据暗纹东方鲀与其他13种鱼的COI基因序列同源性所建立的进化树,与传统的分类地位基本吻合。推定的这二种tRNA的二级结构都具有典型的三叶草型结构。     

饲料中添加菊粉对暗纹东方鲀幼鱼生长、 消化及非特异性免疫能力的影响

为探讨菊粉对暗纹东方鲀（Takifugu obscures）幼鱼生长、消化及免疫能力的影响,利用单因素实验设计,选取640尾暗纹东方鲀,体重（6.97 ± 1.32）g,随机分为4组,每组设4个重复,在日粮中添加不同浓度的菊粉（0%、0.25%、0.5%、1%）,连续投喂8周后测定鱼体生长、肌肉营养成分、肠道消化酶和肝非特异性免疫酶活性。结果显示,各菊粉添加组的生长指标无显著性差异（P > 0.05）;0.25%组肌肉的粗脂肪含量（0.87%）显著高于0.5%组（0.82%）和1%组（0.76%）;0.25%组肌肉的粗蛋白含量（18.75%）显著高于1%组（18.50%）,与对照组（18.62%）和0.5%组（18.60%）无显著差异。暗纹东方鲀幼鱼肠道组织的胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均随着菊粉添加量的增加而呈逐渐上升的趋势。0.5%菊粉添加组肝组织的谷胱甘肽过氧化物酶和总超氧化物歧化酶活性极显著（P < 0.01）高于其余处理组;0.5%组的过氧化氢酶活性也极显著（P < 0.01）高于0.25%和1%组;丙二醛含量随着菊粉添加量的增加而呈递减的趋势。因此,菊粉添加量以0.5%为宜,对暗纹东方鲀幼鱼的生长无显著影响,但对其消化酶活性和非特异性免疫酶活性均具有促进作用。     

暗纹东方鲀线粒体基因组核苷酸全序列测定与分析

以暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)肝的线粒体DNA为模板,参照红鳍东方鲀(T.rubripes)等近源鱼类的线粒体基因组DNA序列,设计合成14对特异引物,进行PCR扩增并测序,首次获得了暗纹东方鲀线粒体基因组全序列。结果表明,暗纹东方鲀线粒体基因组序列全长16 444 bp(GenBank登录号为GQ409967),A+T含量为55.8%,其mtDNA结构与其他脊椎动物相似,由22个tRNA基因、2个rRNA基因、13个蛋白质编码基因和1段819 bp非编码的控制区(D-loop)所组成。蛋白质基因除COⅠ和ND6的起始密码子为GTG、CCT以外,均为典型的起始密码子ATG。ND1、ATPase8、COⅢ、ND4L、ND5、Cyt b使用典型的终止密码子TAA,其他的使用不完全终止密码子。除ND6和tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer、tRNAGlu、tRNAPro在L-链上编码之外,其余基因均在H-链编码。基因排列顺序与已测定的鲀类一致,这显示了鲀类线粒体基因排列顺序上的保守性。tRNA基因核苷酸长度为64～73nt,预测了22个tRNA基因的二级结构,均呈较为典型的三叶草状。基于19种鲀类mtDNA全序列构建的进化树表明,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀、中华东方鲀(T.chinensis)聚成一个姊妹群。结果还支持东方鲀属鱼类为一单系类群。     

野生和人工养殖的暗纹东方鲀毒性的比较

长江的鲀形目鱼类资源主要有两种,暗纹东方(Fugu obscurus Abe)和弓斑东方Fugu ocellatus(Linnaeus.研究结果表明 :与野生的弓斑东方鲀相比较,野生的暗纹东方鲀的毒性比较低。现在已有人工养殖的暗纹东方鲀,那么它们的毒性是否也像红鳍东方鲀一样,经过人工养殖后毒性有所下降,甚至变为无毒,因此食用更加安全了呢 ?为此,作者进行了研究。       

来曲唑对暗纹东方鲀性腺分化及相关基因表达的影响

为了解雌激素在鱼类雌性性别分化中的作用,在克隆暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)性腺CYP19A和DMRT1基因部分序列基础上,采用不同浓度芳香化酶抑制剂来曲唑(letrozole,LE)(0、25、125、625、3 125μg/L)处理暗纹东方鲀初孵仔鱼,每个平行组各20尾鱼,观察CYP19A和DMRT1基因的表达情况和组织学变化。RT-PCR结果显示:25μg/L LE实验组中样本CYP19A和DMRT1表达水平与对照组相比无显著差异;LE 125μg/L以上各浓度组中约30%的样本同时表达CYP19A和DMRT1基因,且随着LE浓度增加,CYP19A表达量下调,而DMRT1表达量上调;组织学研究表明,125μg/L LE以上各实验组样本中可见由雌性向雄性转变的间性体性腺。孵化后56 d,125μg/L LE实验组样本中约有20%显示雌性;625μg/L LE实验组样本显示表型雄性和间性体,未见雌性;最高浓度3 125μg/L LE组中所有样本均显示表型雄性,CYP19A和DMRT1基因表达与对照组雄性相同。上述结果说明,抑制内源雌激素合成可使暗纹东方鲀仔稚鱼CYP19A基因表达下调,同时DMRT1基因表达上调,并发生雄性化性逆转。     

暗纹东方鲀应激胀气行为功能形态学观察

该文以四齿鲀科(Tetraodontidae)的暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)为对象,采用形态学解剖、X光透视和骨骼神经染色等方法,对其胀气行为的功能形态学进行研究。其结果发现,暗纹东方鲀腹部受到刺激后,口腔小幅高频将水或空气吞咽进入由食道腹壁特化成的气囊里,气囊与消化道的前后结合处由括约肌控制,腹壁肌呈束状,与此同时,高弹性的皮肤、脊柱和神经都会发生相应的位移变化,以保证胀气行为的快速完成。通过对暗纹东方鲀胀气行为及其吸、排水机制的深入了解,为进一步研究胀气行为的神经机理奠定基础,也将会丰富动物警戒逃避行为的理论。     

东方鲀生长激素基因3''''-UTR多态性分析

以暗纹东方鲀（Takifugu. Obscurus）、红鳍东方鲀（Takifugu. Rubripes）、星点东方鲀（Takifugu. niphobles）共82个个体为对象,运用单链构向多态性（SSCP）技术和测序技术分析生长激素（Growth Hormone,GH）基因3＇非翻译区的多态性.结果表明3个群体中3＇非翻译区存在两种长度多态性,分别为320bp和317bp,与GenBank（登录号为：FRU63807）的序列（316bp）有差异;共检测到6种基因型,分别命名为aa、bb、ab、bc、cd、dd,变异频率达4.36%,其中在暗纹东方鲀中检测到四种aa、bb、ab、bc,cd和dd基因型分别只在于星点东方鲀和红鳍东方鲀检测到;7个突变位点中有1处颠换即位点212（T→G）,6处转换即位点120、180、227、265、287（C→T）和位点199（A→G）.     

暗纹东方鲀年龄鉴定的研究

用耳石、脊椎骨、鳃盖骨等识别和鉴定暗纹东方鲀(Takifugu obscurusAbe)的年龄,在描述其轮纹特征基础上,比较其在判读暗纹东方鲀年龄和生长特征上的异同与准确性。结果表明,耳石磨片上的轮纹特征明显、清晰且规律性强,是最好的年龄鉴定材料;脊椎骨轮纹也很清晰,但测量时有一定难度,也是较好的年龄鉴定材料;鳃盖骨上年轮较难判定,只能作为辅助材料。本文还对牙齿能否作为年龄鉴定材料进行了观测。       

Puffer smells tetrodotoxin

Behavioral observation was conducted to test whether olfaction is functional to detect tetrodotoxin (TTX) in tiger puffer Takifugu rubripes using Y-maze. We placed either agarose carrier or one agarose and one agarose containing TTX (200 MU) at each head of the channel of Y-maze. Then three non-toxic hatchery-reared juveniles (body length, 5.6 ± 0.4 cm; n = 18) were released into the Y-maze and pecking behavior to carrier was observed for 3 h. The same procedure was tested for olfactory-ablated juveniles and for juveniles taht received sham operation. Juveniles showed significant selectivity to TTX, except for olfactory-ablated juveniles. These results indicate that pufferfish detects TTX by olfactory organ.     

暗纹东方同工酶生化表现型的研究

利用聚丙烯酚胺凝胶垂直平板电泳方法,对暗纹东方的心、肝、肾,肌、性腺５种不同组织的７种同工酶（ＥＳＴ、ＬＤＨ、ＰＯＤ、ＭＤＨ、ＳＯＤ、ＳＤＨ、α－ＡＭＹ）进行了研究,讨论了各同工酶的基因表达谱式,观察到ＥＳＴ同工酶存在着多态现象;ＬＤＨ同工酶有二个基因位点,但只表现３条带,Ａ与Ｂ亚基的结合受阻;ＭＤＨ同工酶存在性别差异,说明决定ＭＤＨ同工酶表达的因素在不同性别中存在差异;ＳＯＤ同工酶有３个基因位点。各同工酶酶谱稳定,有组织特异性,倡ＥＳＴ、ＭＤＨ、ＳＯＤ、ＰＯＤ同工酶在各组织器官中又表现出较大的一致性,有利于物种的鉴定。α－ＡＭＹ与ＳＤＨ只在个别组织中有活性,可能与特定组织与器官的形态发生与机能分化有关。     

暗纹东方TUN 同工酶生化表现型的研究

利用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳方法,对暗纹东方|TUN|的心、肝、肾、肌、性腺5种不同组织的7种同工酶(EST、LDH、POD、MDH、SOD、SDH、α-AMY)进行了研究, 讨论了各同工酶的基因表达谱式,观察到EST同工酶存在着多态现象;LDH同工酶有二个基因位点,但只表现3条带,A与B亚基的结合受阻; MDH同工酶存在性别差异,说明决定MDH同工酶表达的因素在不同性别中存在差异;SOD同工酶有3个基因位点。各同工酶酶谱稳定,有组织特异性,但EST、MDH、SOD、POD同工酶在各组织器官中又表现出较大的一致性,有利于物种的鉴定。α-AMY与SDH只在个别组织中有活性,可能与特定组织与器官的形态发生与机能分化有关。 Abstract:By means of polyacrylamid gel electrophoresis seven isozymes(EST.LDH,SOD,MDH,SDH, α-AMY)in heart,liver,kidney,muscle and gonad of Fugu obscurus were studied.The gene expression patterns of each isozyme were analyzed.The results indicated that polymorphism was detected in EST isozymes;LDH isozymes had two loci,but only three bands could be observed,the random association of two subunits(A and B)were restricted;Some MDH isozymes existed sexual differences in identical tissues.The suggested that the factors controlling the expression of MDH isozymes were different between sexes.All the isozyme phenotypes exhibited tissue-specificity and stability,but EST,MDH,SOD and POD isozymes showed relatively consistence in the five tissues.Their characteristic bands could be used in species determination.The activities of SDH andα-AMY isozymes could only be detected in some tissues and closely correlated to the morphological or functional differentiation of those tissues or organs.     

暗纹东方鲀毛霉菌感染的组织病理学观察

对病症表现为溃疡性疾病的暗纹东方纯(Takifagu obscurus)进行了病原菌培养和组织病理观察.镜检溃疡和肌肉组织,可见丝状型粗大、无隔、分枝,革兰氏染色阳性的真菌菌丝.心、肝、脾和肠组织有少量炎细胞侵润,未见真菌菌丝和明显组织病理变化.经Sabouraud培养基培养观察,37℃,24 h菌丝顶端有淡黄色球形孢子囊;72 h出现气生菌丝,孢子囊成熟,释放卵圆形孢囊孢子;120 h后菌落充满平皿.肌体溃疡处皮下和肌肉组织切片镜检显示,大量菌丝体侵入皮下组织,炎细胞侵润,引起邻近肌肉组织变性坏死和间质水肿;粗大菌丝穿透粘膜入侵基底组织,同时导致小血管发生栓塞;菌丝着色显蓝色、分枝、呈直角.依据Ainsworth真菌分类系统鉴定为毛霉属(Mucor sp.)真菌.     

Sodium and Potassium Distribution in Puffer Fish Supramedullary Nerve Cell Bodies

The Na and K concentration in single supramedullary neurons of the puffer fish (Spheroides maculatus) was measured using a dual channel integrating ultramicroflame photometer. The cells were frozen in situ, sectioned at low temperatures, and freeze-dried to prevent artefactual movements of cations. The density of the nuclear fragments was 0.15, significantly less than cytoplasm's 0.21. The sucrose-¹⁴C "space" was 2.1–4.7% in cytoplasm fragments and 0.9–2.1% in nuclear fragments. The K concentration in cytoplasm averaged 134 mmoles/liter tissue volume and in nuclei, 113. The Na concentration in cytoplasm fragments varied between 56 and 138 mmoles/liter per tissue volume; in nuclei between 40 and 135, and in perineural tissue between 55 and 114. This intracellular Na is several times greater than the Na concentration expected from previous estimates. It is probable, however, that the intracellular Na activity is less than half that of the Na concentration, suggesting that much of the intracellular Na is bound to organic molecules within the cell.     

4种河鲀全基因组微卫星分布特征分析

本研究利用MISA软件对四种河鲀全基因组中的微卫星进行筛选并分析.结果如下:在红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)(391.49 Mb)、菊黄东方鲀(T.flavidus)(366.29 Mb)、双斑东方鲀(T.bimaculatus)(371.68 Mb)及黑青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)(342.40 Mb)全基因组中,分别筛选出142 885个、135 009个、147 549个和179 703个完整型微卫星.相对丰度分别为365个/Mb,369个/Mb,397个/Mb和525个/Mb.微卫星总长度分别为2 876 322 bp,2 689 710 bp,3 140 445 bp 和3 615 069 bp,分别占基因组序列总长度的0.73％,0.73％,0.84％和1.06％.在1～6个不同碱基重复类型完整型微卫星中,四种河鲀的6种碱基类型数目排序是一致的.均是单碱基重复数目最多,然后依次是二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基.其中AC,A,C,AG,AGG,AT,AAT和AAC是四种河鲀共有的常见核心重复类别.东方鲀属(Takifugu)三种河鲀基因组微卫星分布特征极为相似,分析红鳍东方鲀和双斑东方鲀的遗传距离可能更为接近.鲀属(Tetraodon)黑青斑河鲀与其他三种东方鲀属河鲀除部分微卫星特征相似外,在微卫星总数、微卫星相对丰度和密度、部分碱基类型数目及类别方面和东方鲀属差距较大.这可能与两属鱼类地理分布及进行滑动复制的碱基组成有关,推测东方鲀属和鲀属基因组可能具有独特的进化机制.本研究为多种河鲀基因组特征分析、多种河鲀微卫星引物设计、不同属种河鲀遗传距离及亲缘关系的探究等奠定了基础.     

Analysis of K Inactivation and TEA Action in the Supramedullary Cells of Puffer

Under the voltage clamp condition, the K inactivation was analyzed in cells bathed in the isosmotic KCl Lophius-Ringer solution. After conditioning hyperpolarization, the cells respond to depolarizations with increased K permeability, which in turn is decreased during maintained depolarizations. The steady-state levels of the K inactivation as a function of the membrane potential are related by an S-shaped curve similar to that which describes the steady-state Na inactivation in the squid giant axon. TEA reduced the K conductance by a factor which is independent of the potential, and without a shift of the inactivation curve along the voltage axis. The rapid phase of the K activation is less susceptible to TEA than the slow phase of the K activation. Hyperpolarizing steps remove the K inactivation, the rate of the removal being faster the larger the hyperpolarization from the standard potential of about -60 mv.     

提取TTX后鲀鱼废物的氨基酸分析

我国鲀鱼类资源丰富,鲀鱼肝脏、卵巢提取ＴＴＸ后的废物中,含有１７种氨基酸,其含量合计占干物质的７１．５％,其中人和动物必需的８种氨基酸中Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ和Ｌｙｓ６种含量较高,总量占干物质的２７．６％以上。     

鄱阳湖野生河豚鱼体内河豚毒素产生菌的分离鉴定(英文)

从中国鄱阳湖捕获的暗纹东方鲀卵巢中分离到4株菌,通过小鼠实验、薄层色谱、质谱分析及荧光分光光度法确认TL-1菌株发酵液中含河豚毒素。24℃培养5 d,通过活性炭柱、凝胶柱从TL-1发酵液中分离河豚毒素粗毒液。经形态、生理生化及16S rRNA分析鉴定,表明该菌属于花域芽孢杆菌属。本研究首次报道从鄱阳湖河豚鱼中分离到产毒菌。