一种新型ω-转氨酶的工业适应性选择

尽管ω-转氨酶被认为是手性胺合成中极具工业潜力的生物催化剂,但是由于受限于酶的热不稳定及不利的反应平衡,能直接适用于工业的野生酶极少。为了发现工业适应潜力的新型ω-转氨酶,文中设计了包括底物、序列、克隆、酶活、转化率及酶学的工业适应性选择流程,并对各筛选步骤中存在的问题进行了研究,进而从土壤宏基因组中筛选出了一种来源于柄杆菌属的新型ω-转氨酶ATA-W12,以异丙胺为供体在1 mL反应体系中转化了85.84% 1-Boc-3-吡咯烷酮 (20 mmol/L) 和67.42% 1-Boc-3-哌啶酮 (20 mmol/L)。酶学筛选发现,ATA-W12在40 ℃孵育168 h活力维持不变;优选反应条件为pH 8.5、40 ℃;这些特征利于工业用理想氨基供体异丙胺的使用。笔者已采用ATA-W12实现了100 g/L光学纯(S)-(+)-1-Boc-3-氨基哌啶的50 mL实验室规模制备,为进一步工业化生产打下基础。     

从专利角度分析ω-转氨酶在我国手性胺生物合成应用中的研究进展

转氨酶能够催化氨基在氨基酸、烷胺、芳香胺等多种氨基化合物和醛、酮、酮酸等羰基化合物之间的可逆转移。由于其底物范围广、立体选择性高、催化条件温和等特点,ω-转氨酶已在手性胺绿色生物合成中展现了巨大应用前景。开发高效、特异、环保且具有自主知识产权的手性胺合成应用技术,对我国医药、农药、材料产业的发展具有重要意义。本文从应用技术角度,对近10年来我国机构报道的ω-转氨酶相关中国专利进行了系统分析,重点从ω-转氨酶资源开发、酶性能的蛋白工程改造、在手性胺合成中的应用现状、催化转化技术工艺4个方面对我国ω-转氨酶在手性胺生物合成领域的研究进展进行阐述,以期为ω-转氨酶基础理论的深入研究和相关应用技术的推广提供参考。     

删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高 (R)-ω-转氨酶热稳定性

手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-TA的研究较少,但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的(R)-ω-TA的热稳定性,将有利于手性胺的制备。本文利用Py MOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的(R)-ω-TA中具有高温度因子(B-factor)的Loop区域,通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明,突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1℃和39.4℃,比野生酶提高了2.6℃和0.9℃;在40℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min,为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外,在400 K和10 ns的分子模拟条件下,突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)比野生型低,突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除(R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。     

半理性设计进化土曲霉来源的ω-转氨酶AtTA热稳定性

转氨酶(ω-transaminase,ω-TA)作为一种天然的生物催化剂,在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景。但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷,大大限制了ω-TA的应用。为改善此缺陷,针对来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的(R)-ω-TA(At TA),采用基于分子动力学模拟的计算机辅助设计与随机突变、组合突变相结合的策略进行酶的热稳定性改造,获得了热稳定性与活性同步提高的最佳突变酶At TA-E104D/A246V/R266Q (M3)。与At TA野生酶(wild-type, WT)相比,M3的半衰期t_1/2 (35℃)由17.8 min提升至102.7 min,提升了4.8倍,半失活温度T₅₀¹⁰比WT (38.1℃)提高2.2℃。最佳突变酶M3对丙酮酸和1-(R)-苯乙胺的催化效率分别是野生酶的1.59倍和1.56倍。分子动力学模拟与分子对接结果表明,分子内氢键与疏水相互作用的增加所导致α-螺旋的加固稳定是酶热稳定性提升的主要原因;底物分子与结合口袋氨...     

一种来源于运动替斯崔纳菌KA081020-065的新型卤醇脱卤酶的表达纯化及性质分析

卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)不仅对于含氯污染物的生物降解、净化环境具有重要意义,而且在手性医药中间体合成中也是一种重要的生物催化剂,但其数量较少。采用基因挖掘在基因组数据库中获得一种来自运动替斯崔纳菌Tistrella mobilis KA081020-065的新型卤醇脱卤酶基因Hhe TM,将该基因克隆、表达在大肠杆菌BL21(DE3)中,利用镍柱亲和层析将该酶进行纯化并研究了其酶学性质。Hhe TM是一种同源四聚体;最适温度为50℃;不同的p H缓冲液对其活性有较大影响;在碱性、30℃以下的条件下稳定性高。在氰根离子存在的条件下,Hhe TM能够催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯,为酶法合成阿托伐他汀关键中间体提供了一种新的卤醇脱卤酶。     

一种来源于蜗牛酶的β-葡萄糖苷酶的纯化

通过DEAE-Sepharose离子交换分段层析、DEAE-Sepharose离子交换梯度层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析三种方法的联用,从中华白玉蜗牛消化酶中提纯出一种β-葡萄糖苷酶。该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带。应用SDS-PAGE和凝胶过滤层析测定其分子量,提示该酶是由4个分子量为110~115 kD的相同亚基组成的同源四聚体。pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189μmol/(min.mg)。     

两种L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达与酶学性质分析

【目的】实现单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)L-天冬氨酸α-脱羧酶基因在Escherichia coli中异源表达,纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。【方法】依照E.coli的密码子偏好性优化来源于L.monocytotogens和C.jeikeium的pan D基因序列。人工合成后以此构建表达载体pET28a(+)-pan D_(Lm)和p ET28a(+)-pan D_(Cj),转化E.coli BL21(DE3),实现panD_(Lm)和panD_(Cj)基因的异源表达。利用亲和层析纯化获得携带组氨酸标签的纯酶后进行酶学性质研究,并考察底物对酶反应的影响。【结果】重组菌蛋白电泳分析结果表明,重组酶panD_(Lm)和panD_(Cj)均有自加工功能,裂解后形成了α亚基和β亚基。重组酶比酶活分别为8.9 U/mg和11.8 U/mg。两种酶的最适反应温度均为60°C,最适p H分别为7.0和6.0,它们都在30-50°C,酸性条件下较稳定。与目前研究最多的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的Pan DC.g相比,Pan DL.m受底物天冬氨酸的抑制作用较小。【结论】panD_(Lm)和panD_(Cj)可在高温酸性条件下特异性转化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,其中panD_(Lm)受底物的抑制作用较小,具有一定的工业应用潜力。     

人心肌胞质天门冬氨酸转氨酶的纯化及性质

从人心肌提纯胞质天门冬氨酸转氨酶同工酶(c-AST)。经匀浆、热处理、硫酸铵分离,进一步用离子交换层析和亲和层析。其比活为220 u/mg。经免疫电泳和PAGE鉴定,达到免疫纯和电泳纯。免疫动物获得较高效价抗体。并对该酶的分子量,等电点和氨基酸组成进行了研究。     

人胎盘酸性β-1,4葡萄糖苷酶的纯化及部分性质

 本文以正常人胎盘为材料,通过匀浆、硫酸铵分级分离、20％正丁醇抽提、Sephadex G-200凝胶过滤及Concanavalin A-Sepharose 4B亲和层析等分离纯化步骤,制备获得了纯化3705倍的酸性β-1,4葡萄糖苷酶,其比活性和获得率分别为277261.33n mol·(mg Prot·h)~(-1)和14.3％。 经agarosn-IEF检验,该纯化的酸性β-1,4葡萄糖苷酶已达蛋白电泳单点纯,PI为5.2。经3～28％梯度PAGE,求知该酶单体分子量为74kD。该纯制酶极不稳定,4℃贮存6天后活性即降低50％以上,与其特异性抗体结合后,活性全部被抑制。     

蜗牛酶中一种β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出1种具有人参皂苷Rb_1水解活性的β-葡萄糖苷酶.纯化后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带.反应最适pH为5.6,最适温度是80 ℃.pH稳定范围很广,在pH为4.0～11.0的溶液中和温度60 ℃以下保持长时间稳定状态,是一个耐碱和中等耐热的糖苷酶.Na~+、K~+、Li~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、EDTA、DTT和SDS不影响该酶活性,而Cu~(2+)、Ag~+和Fe~(3+)对该酶则具有明显的抑制作用.pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189 μmol/(min·mg).