FGFR2Ⅲc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达

目的:构建人FGFR2Ⅲc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2Ⅲc的重组细胞株,初步研究FGFR2Ⅲc对L6细胞的作用.方法:从人胎盘组织中获得FGFR2Ⅲc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2Ⅲc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2Ⅲc.将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2～4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株.RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2Ⅲc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系.结果:构建了舍人FGFR2Ⅲc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2Ⅲc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化.结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2Ⅲc的重组L6细胞株,FGFR2Ⅲc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2Ⅲc基因与成肌分化功能相关性奠定基础.     

FGFR2IIIc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达

目的:构建人FGFR2IIIc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2IIIc的重组细胞株,初步研究FGFR2IIIc对L6细胞的作用。方法:从人胎盘组织中获得FGFR2IIIc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2IIIc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2IIIc。将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2~4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株。RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2IIIc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系。结果:构建了含人FGFR2IIIc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2IIIc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化。结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2IIIc的重组L6细胞株,FGFR2IIIc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2IIIc基因与成肌分化功能相关性奠定基础。     

含EGFP报告基因的慢病毒载体的构建及有感染能力病毒的制备

目的:构建含EGFP报告基因的慢病毒表达载体,包装成病毒并测定病毒感染效率。方法:以pEGFP-C1为模板扩增EGFP基因,经PstⅠ和XhoⅠ酶切后与载体连接,得到慢病毒表达载体pLenti6/v5-EGFP;将此载体与包装质粒共转染包装细胞制备病毒,测定不同感染复数(MOI)下病毒的感染效率。结果与结论:构建了含EGFP报告基因的慢病毒表达载体,制备了有感染能力的慢病毒。     

PEX慢病毒载体构建及其在293FT细胞中的分泌表达

目的 构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293FT细胞中分泌表达PEX蛋白.方法 利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒（pLP1、pLP2）、包膜质粒（pLP/VSVG）共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并进行滴度测定.慢病毒感染2931;3＂细胞后,Western印迹法检测293FI＂细胞培养上清中PEX的表达.结果 酶切和DNA测序表明慢病毒表达载pBPLV-signal-PEX构建正确,四质粒共转染293FT细胞成功获得慢病毒;慢病毒感染293FT细胞后,在细胞培养卜清中可检测到PEX蛋白的表达.结论 成功构建了含人PEX的重组慢病毒,在体外有效感染293fT细胞并持续分泌表达目的 蛋白,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供实验基础.     

含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装及滴度测定

目的：包装含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒并测定其滴度,用于获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的基因治疗研究。方法：从CCR5Deha32突变个体外周血单个核细胞（PBMC）中提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Deha32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm—T载体连接,随后转化EcoliDH5ct,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序;将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6／V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析;用pLP1、pLP2、pLP／VSVG及pLenti-CCR5Delta32等4种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并测定其滴度。结果：克隆出人CCR5Deha32基因,并构建了含该基因的重组慢病毒载体,经293T细胞包装后产生5×10^5TU／mL的重组慢病毒。结论：高滴度含人CCR5Deha32基因重组慢病毒的包装,为进一步的AIDS基因治疗研究奠定了基础。     

慢病毒GFP质粒的构建及脂质体介导鸡胚细胞中瞬时表达动力学初步研究

GFP(green fluorescent protein)是一种用于检测细胞的基因表达和蛋白定位的报告基因,pLenti6/V5-D-TOPO是高效的慢病毒类表达载体.实验利用PCR(polymerase chain reaction)从质粒pEGFP-N1中扩增了EGFP 基因片段,再利用高效、快速、定向的TOPO克隆法将扩增片段克隆到pLenti6/ V5-D-TOPO载体中,构建了既能高效转染细胞又能方便观察蛋白表达情况的pLEGFP重组载体.通过PCR法鉴定及瞬时转染,结果显示,GFP基因正确地插入载体中,并能够在Hela细胞及鸡胚X期细胞中瞬时表达,但重组和对照质粒瞬时转染效果存在明显差异.通过该研究证实分子量大小、质粒和脂质体比例是影响转染的关键因素,也为转基因的研究提供了一种方法.     

人生长激素慢病毒载体的构建及其在鼠骨骼肌成肌细胞中的表达

构建能表达人生长激素(hGH)的pLentivirus6/V5-hGH载体,并实现hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达。体外培养SD鼠骨骼肌成肌细胞,并通过免疫组织化学方法鉴定所得细胞、用台酚兰染色确定培养细胞的活性并绘制生长曲线。将目的基因hGH亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLentivirus6/V5-hGH。将pLenti6/V5-hGH及阳性对照质粒pLenti6/V5-EGFP分别用Lipofectamin2000介导转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。在激光共聚焦扫描显微镜下计数,确定阳性对照质粒的转染数,从而估计该基因的转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源生长激素(GH)的成肌细胞。收集转染及筛选后的细胞培养基,用放射免疫分析法(RIA)检测重组人生长激素(rhGH)的表达水平。聚合酶链式反应法(PCR)及DNA测序显示hGH基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;阳性对照质粒转染细胞24h后,在激光共聚焦显微镜下观察,其转染效率达40%以上。检测收集的上清,与对照组相比,有极显著差异(P<0.01),观察至第8周,rhGH仍持续稳定表达。通过检测培养的chang-liver肝细胞上清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的水平,验证了rhGH的生物学活性。实验通过培养高纯度的成肌细胞,构建了能在真核细胞内表达hGH的重组质粒pLenti6/V5-hGH,实现了hGH基因在骨骼肌成肌细胞中大量、长期和稳定的表达,并且获得的rhGH具有较强的促进肝细胞分泌IGF-1的能力。     

靶向ADAM17基因RNA干扰慢病毒载体的构建及慢病毒包装

目的构建靶向ADAM17基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体及包装慢病毒。方法根据人ADAM17mRNA序列设计4个靶序列,合成4对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上5对寡核苷酸序列退火后连入pLVTHM质粒,经酶切和测序鉴定。将重组慢病毒质粒转染至A549细胞,以Real-time PCR检测A549细胞中ADAM17 mRNA表达。将干扰效果最佳的质粒载体和包装质粒共转染至293T细胞,包装产生病毒颗粒。以流式细胞术检测重组慢病毒的滴度。结果酶切和测序证实干扰靶序列已被准确克隆到pLVTHM质粒载体。pLVTHM-ADAM17-siRNA1-4均可显著抑制A549细胞ADAM17 mRNA的表达,其中pLVTHM-ADAM17-siRNA4的抑制效果最佳。LV-ADAM17-siRNA4重组慢病毒的滴度为2.16×108TU/ml。结论成功构建了靶向人ADAM17基因RNAi慢病毒载体及包装了重组慢病毒。     

人肾脏相关基因Nox4过表达慢病毒载体的构建与定位检测

目的:克隆Nox4基因入pLenti6.3慢病毒表达载体,为探索Nox4基因在ROS产生中的作用提供实验基础。方法:根据NCBI人Nox4 mRNA序列设计引物,再利用酶切连接反应将Nox4插入到入门载体pENTR3C中,成功构建pENTR3C-Nox4后,通过LR反应,将Nox4和EGFP tag插入到慢病毒表达载体pLenti6.3中,经酶切和测序验证正确后,将重组表达质粒转染入人Hela细胞,通过Western-Blot验证Nox4的表达情况,免疫荧光验证Nox4在细胞内的定位情况。结果:入门载体及表达质粒测序比对完全正确,转染Hela细胞后可见明显的表达条带,并且主要定位于细胞器内质网中。结论:成功构建了带有EGFP tag的Nox4基因慢病毒重组表达载体,转染Hela细胞后,其能正确表达并定位于内质网中,为研究Nox4在调节ROS产生中的作用奠定了基础。     

慢病毒重组同源盒基因HOXA4表达载体的构建及其感染人脐带间充质干细胞的实验性研究

目的 构建携带同源基因HOXA4的慢病毒表达载体,并测定其对人脐带间充质干细胞的感染效率.方法 使用酶切及PCR技术从含有HOXA4基因的质粒克隆模版HOXA4-MSCV逆转录载体中获取目的 基因HOXA4,并将HOXA4基因重组到慢病毒载体表达质粒上Lenti-GFP-CTB,通过酶切、测序验证HOXA4基因后,将Lenti-GFP-HOXA4质粒、和辅助包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、PMD2G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带HOXA4基因的重组慢病毒Lentiviral-HOXA4;然后感染人脐带间充质干细胞,通过荧光显微镜及流式细胞术检测其感染效率.结果 成功构建携带HOXA4基因的慢病毒表达载体Lentiviral-HOXA4,并获得高纯度的慢病毒浓缩液.经检测病毒滴度达2.11×108 TU/ml.成功转染HOXA4基因的脐带间充质干细胞表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数（MOI）值为60时转染效率最高,达（95.4±4.3）%.结论 成功构建携带人HOXA4基因的慢病毒,并可以在体外有效转染人脐带间充质干细胞.