鸡传染性支气管炎病毒变异株的分离及其S1基因序列分析

本实验对山东省泰安地区某蛋鸡场产蛋下降鸡群发生的临床症状疑似鸡传染性支气管炎病例,无菌采集气管、肺脏、肾脏等组织,接种SPF鸡胚,经病毒形态观察、血凝特性试验、动物回归试验等证实,我们鉴定到一株鸡传染性支气管炎病毒(IBV);病毒中和试验表明,该病毒为一株变异毒株,使用国外针对IBV 793/B血清型发表的血清型特异性引物经RT-PCR方法获得了该毒株的免疫原基因S1基因,初步确定该传染性支气管炎病毒变异毒株为793/B血清型.     

传染性支气管炎病毒江苏分离株核蛋白基因序列测定与同源性分析

将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株JS／95／03接种鸡胚,分离、纯化病毒,提取单股RNA做为反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物,使用单管RT－PCR方法,物异扩增IBV核蛋白（N）基因5'端854bp的片段,扩增产物纯化后测,序列分析表明,IBV N基因也存在较大变异,此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性最高。     

传染性支气管炎病毒江苏分离株 核蛋白基因序列测定与同源性分析

将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株JS/95/03接种鸡胚,分离、纯化病毒,提取单股RNA做为反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物,使用单管RT-PCR方法,特异扩增IBV核蛋白（N）基因5'端854 bp的片段。扩增产物纯化后测序,序列分析表明,IBVN基因也存在较大变异,此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性最高。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株全基因组序列分析

为了明确传染性性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)分离株CK/CH/SD09/005的分子特征,以进一步丰富国内IBV的分子流行病学信息。本研究设计了25对引物对其全基因组进行了序列测定,并与参考株进行了同源性比较和S1基因遗传进化分析。结果显示CK/CH/SD09/005基因组为27 691bp(不包括5′端Cap和3′端Poly A)。全基因组同源性比对发现,CK/CH/SD09/005仅与GenBank中广西2009年分离株GX-NN09032各基因高度同源(97%~99%)。除GX-NN09032外,CK/CH/SD09/005基因组5′端复制酶基因(Gene 1)和3′端非转录区(Untranslated region,UTR)与2个QX基因型参考株ck/CH/LDL/091022和SDIB821/2012同源性最高,分别为97%和98%,但是3′端结构蛋白和非结构蛋白基因(S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N)与这两个毒株同源性较低,仅为72%~90%。其ORF3c/E、5a、5b和N分别与韩国分离株1011、国内分离株CK/CH/LXJ/02I、DK/CH/HN/ZZ2004和YX10同源性最高,分别为97%、96%、99%和96%,而其ORF3a、3b和M与参考株同源性均低于90%。S1基因遗传进化分析发现,CK/CH/SD09/005和国内外39个参考株形成7个进化分支(基因型),CK/CH/SD09/005和2007以来几个分离株属于基因Ⅳ型,与其它6个基因型参考株S1和S2基因同源性为66%~69%和72%~81%,S1基因不仅表现广泛性点突变,而且有多处碱基插入和缺失,S2仅表现点突变。本研究结果表明CK/CH/SD09/005是一个变异株,可能是QX基因型IBV流行株与其它毒株重组进化而来,此外还涉及基因突变、插入和缺失等多种变异机制。     

鸡传染性支气管炎病毒两个地方分离株S1基因的扩增克隆与序列分析

对IBV肾型毒株JS/95 /0 3和呼吸型毒株SD/97/0 1的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定 ,将两毒株的S1基因序列与 10个参考毒株进行了比较。结果表明 ,JS/95 /0 3和SD/97/0 1分别与M41和H12 0株亲缘关系最近 ,它们可能是疫苗毒株的变异株。JS/95 /0 3和SD/97/0 1间的亲缘关系也较近 ,两者S1蛋白中只有 2 4个氨基酸的差异 ,其中有 15个位于前 130个氨基酸中 ,第 116位氨基酸可能与毒株的致病性有关。对两毒株S1蛋白的二级结构进行了预测和比较 ,结果发现 ,一个或极少数氨基酸的差异即可导致S1蛋白二级结构和抗原性的改变     

鸡传染性支气管炎病毒两个地方分离株S1基因的扩增克隆与序列分析

对IBV肾型毒株JS/95/03和呼吸型毒株SD/97/01的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定,将两毒株的S1基因序列与10个参考毒株进行了比较.结果表明,JS/95/03和SD/97/01分别与M41和H120株亲缘关系最近,它们可能是疫苗毒株的变异株.JS/95/03和SD/97/01间的亲缘关系也较近,两者S1蛋白中只有24个氨基酸的差异,其中有15个位于前130个氨基酸中,第116位氨基酸可能与毒株的致病性有关.对两毒株S1蛋白的二级结构进行了预测和比较,结果发现,一个或极少数氨基酸的差异即可导致S1蛋白二级结构和抗原性的改变.     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆,序？…

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株ＱＤ免疫原Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了克隆,序列分析了和ＤＮＡ免疫的初步研究,ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＱＤ毒株的Ｓ１基因,将其５′和３′端分别进行了分子修饰后插入克隆载体ＰＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄⅢ位点,大肠杆菌中实现了目的基因的克隆,利用英国ＩＢＶ毒株Ｓ１全基因核酸探针与ＱＤ毒株Ｓ１基因的重组克隆质粒子分杂交后,采用ＨａｅⅢ,ＰｖｕⅡ和ＸｂａＩ等限制酶对此     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株ＱＤ免疫原Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了克隆、序列分析和ＤＮＡ免疫的初步研究。ＲＴＰＣＲ扩增ＱＤ毒株的Ｓ１基因,将其５′和３′端分别进行分子修饰后插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国ＩＢＶ毒株Ｓ１全基因核酸探针与ＱＤ毒株Ｓ１基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用ＨａｅⅢ,ＰｖｕⅡ和ＸｂａⅠ等限制酶对此流行毒株Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了酶切分析;在测定ＱＤ毒株Ｓ１基因５′端高变区核苷酸序列并以此与ＩＢＶＭ４１,Ｈ１２０,６／８２及Ｂｅａｕｄ等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了ＱＤ株Ｓ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,ＩＢＶＳ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)S2蛋白基因的序列测定和分析

根据GenBank上发表的IBV S2基因序列,自行设计了两对引物,分别扩增SD／97／02株S2基因的上游1100bp部分和下游的900bp部分,两段序列拼接后包含了S2全基因的序列。将此两段分别克隆入pGEM T-easy载体,测序后将序列用分析软件DNASTAR和网上的BLAST软件进行分析,结果表明,S2基因比S1基因相对来说更保守,位于氨基酸第560－600位很有是与囊膜锚着的部位,而S2与S1的交界处以HRRRR为特征,这不同地常规的RRF／SRR。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

IBV青岛腺胃分离株（SD／97／02）S1蛋白基因的序列测定和分析

参考Genbank上发表的IBV S1纤突蛋白基因序列,设计了一对引物,对鸡传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株（SD／97／02）RNA进行RT－PCR扩增。将PCR产物克隆入pMD18-T载体中进行序列测定和分析。序列分析表明,该毒株的S1基因的G＋C％含量较少,为37.0%,存在HindⅢ,BamHⅠ,BglIⅠ,SacⅠ和SalⅠ位点,无EcoRⅠ位点,与其他毒株的同源性在87.02%－94.21%之间,在第154－429nt处为高度的变异区;将基因序列翻译成氨基酸后,假定的S1蛋白由540个氨基酸组成,等电点8.24,在蛋白质内部存在18个Cys,在S1与S2蛋白之间的剪切位点为HRRRR,这与大多数IBV毒株（RRF／SRR）不一样,有三个区域的氨基酸序列高度保守;169－181aa,230-250aa,485-506aa;与其他毒株进行抗原性比较后发现,在该毒株的320－326aa及390－401aa处的抗原表位消失,而在325－345aa、379－389aa处则出现了很强的抗原表位;第438－444aa处,其他IBV毒株（除ZJ971株外）原来存在的强抗原位点在本毒株中消失。在53－65位的氨基酸抗原性与其他毒株相比明显变弱。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株(793/B)核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV 793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析.结果表明,IBV 793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV 793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失.N基因的核苷酸同源性为86.9%～91.4%,氨基酸同源性为75.8%～77.5%.表明IBV 93/B的N基因存在着较大的变异性.     

鸡传染性支气管炎病毒变异株（793／B）核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析。结果表明,IBV793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失。N基因的核苷酸同源性为86.9%～91.4%,氨基酸同源性为75.8%～77.5%。表明IBV93/B的N基因存在着较大的变异性。     

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA。参照IBV Bcaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT—PCR,成功地扩增出IBV H株S1基因。扩增产物经Bst YⅠ Hae Ⅲ和Pst Ⅰ酶切分析,结果表明,IBV H株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBV H株为Mass血清型。将IBVH株S1基因克隆于pGEM—T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97．39％和97、27％。将IBV H株S1基因亚克隆到pPICZ—A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS—PAGE实验证实了IBV H株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测．证实了表达产物的抗原特异性。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

鸡传染性支气管炎病毒E蛋白基因的表达

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病是危害全球养禽业的重要传染病之一[1,2]。其感染的主要特征是气管啰音、咳嗽和打喷嚏?送猓?该病还可以引起蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降。雏鸡可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡。虽然疫苗的使用对IB的流行起到了一定的预防和控制作用,但由于IBV血清型众多,不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性。因此,IB目前仍在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播,给养禽业造成了严重…     

鸡传染性支气管炎病毒E蛋白基因的表达

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病.该病是危害全球养禽业的重要传染病之一[1,2].其感染的主要特征是气管啰音、咳嗽和打喷嚏.此外,该病还可以引起蛋鸡产蛋量下降和蛋品质下降.雏鸡可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡.虽然疫苗的使用对IB的流行起到了一定的预防和控制作用,但由于IBV血清型众多,不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性.因此,IB目前仍在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播,给养禽业造成了严重的经济损失.