转SAMS基因玉米自交系获得及抗旱性分析

以玉米自交系‘掖478’的茎尖为受体,采用农杆菌介导法将小麦抗旱SAMS基因转入玉米中,用PCR和RT-PCR法对转化玉米进行检测,并以18%PEG-6000模拟水分胁迫对T1代转基因玉米和非转基因玉米进行抗旱性分析。结果显示:(1)共转化518个玉米芽,得到453株转化苗。获得T0代阳性植株16株,转化率为3.53%,有14株自交结实,经RT-PCR检测,T1代转基因玉米有9个株系为稳定遗传阳性株系。(2)在同一水分胁迫时间下,转基因玉米的叶片相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量和SOD活性均高于非转基因玉米,而转基因玉米叶片的电导率、MDA含量均低于非转基因玉米。在60 h水分胁迫处理下,转基因玉米叶片相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量和SOD活性比非转基因玉米上升8.16%、20.02%、32.21%、22.77%,而转基因玉米叶片的电导率、MDA含量比非转基因玉米下降14.38%、29.41%。研究表明,通过导入SAMS基因,可以提高玉米的抗旱性。     

农杆菌介导抗储粮害虫转基因小麦(Triticum aestivum L.)的获得及分析

以本实验室选育的小麦优良品系的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞,经筛选获得抗卡那霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR和实时PCR检测、PCR-Southern和Southernblot验证,确定了3株独立再生植株为含有CpTI的转基因植株。农杆菌菌浓度、侵染时间及转化处理方式对小麦转化率均有明显影响。3株转基因植株正常可育并结籽,形成转基因株系。外源基因在转基因植株T1代中的分离呈多样性,部分株系(转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ)表现出孟德尔遗传规律。抗虫试验表明,3株转基因植株T2代籽粒对储粮害虫麦蛾具有一定的抗性,转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ及非转基因植株的T2代籽粒虫蛀率分别为19·8%、21·9%、32·9%和58·3%。转基因植株T1代群体农艺性状调查显示,3个株系具有良好的农艺性状,为小麦的遗传改良提供了新的种质抗虫材料。     

农杆菌介导抗储粮害虫转基因小麦(Triticum aestivum L.)的获得及分析

以本实验室选育的小麦优良品系的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞,经筛选获得抗卡那霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR和实时PCR检测、PCR-Southern和Southern blot验证,确定了3株独立再生植株为含有CpTI的转基因植株。农杆菌菌浓度、侵染时间及转化处理方式对小麦转化率均有明显影响。3株转基因植株正常可育并结籽,形成转基因株系。外源基因在转基因植株T₁代中的分离呈多样性,部分株系（转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ）表现出孟德尔遗传规律。抗虫试验表明,3株转基因植株T₂代籽粒对储粮害虫麦蛾具有一定的抗性,转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ及非转基因植株的T2代籽粒虫蛀率分别为19.8%、21.9%、32.9%和58.3%。转基因植株T₁代群体农艺性状调查显示,3个株系具有良好的农艺性状,为小麦的遗传改良提供了新的种质抗虫材料。     

农杆菌介导法向玉米茎尖导入抗草甘膦EPSPS基因的研究

以玉米自交系郑58的茎尖为受体,通过农杆菌介导法将抗草甘膦EPSPS基因转入玉米中,研究以茎尖为受体的农杆菌转化体系的可行性。98株转化苗,经过300 ppm的除草剂(农达)筛选,共获得13株转基因植株,经PCR检测,其中7株表现阳性,转化率达7.14%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的。     

外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗干旱生理效果研究

以冬小麦品种8901、5-98、99-92和104等品种的幼穗和幼胚为材料,用基因枪转化含逆境诱导转录因子DREB和bar基因的质粒pBAC128F（7024bp）。经筛选与植株再生,共获得70多个转基因小麦植株及其后代株系。转基因株系经PCR分析和RNA点杂交检测,结果表明外源转录因子DREB基因已稳定整合到转基因植株及其后代株系中,并且在部分后代株系中获得了表达。叶片脯氨酸含量测定表明,有16个转基因株系的脯氨酸含量与非转基因对照相比,增加相当显著,其中10个株系的脯氨酸含量在1100μg/g以上,比对照提高了2倍多。室内抗旱模拟实验表明,转基因株系停止浇水15d后,叶片仍然表现绿色,而对照叶片则失绿、枯干;复水10d后,转基因株系恢复活力,对照则死亡。研究表明,利用逆境诱导型启动子（rd29B）来增强外源DREB基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性。     

cryIAc基因在转基因玉米中的遗传规律及对抗虫性影响

旨在研究目的基因在转基因植株和后代植株(株系)中的遗传规律及其对转化植株抗虫性的影响。以花粉介导法将cryIAc基因导入玉米自交系‘郑58’和‘昌7-2’,对转化植株及其后代株系进行分子检测和田间抗虫鉴定。结果表明:(1)转化‘郑58’和‘昌7-2’,T1代分别获得转基因植株24和41个,转化率高达20%以上;(2)转基因T2代、杂交F2代及回交1代(B1)的分子检测结果证明,外源基因的遗传符合孟德尔的3∶1、3∶1和1∶1的遗传分离规律;(3)连续多带的分子检测结果还表明,外源基因可稳定遗传并有效表达,表达水平在9.8-14.3 ng/g叶片鲜重之间;(4)抗虫鉴定结果显示,在阴性对照全部感虫情形下,转基因纯合株系仍表现出较高抗虫活性;(5)此外,回交试验结果还证明外源基因通过杂交可传递给下一代;(6)最终经筛选得到SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007五个高抗虫转基因株系。结果表明,花粉介导法是一种高效、快捷的转化方法,cryIAc基因导入玉米自交系植株后赋予和提高了转基因植株的抗虫活性。     

转水稻NibT基因玉米植株的获得及抗病性研究

以玉米(Zea mays L.)自交系'金黄96B'为受体材料,供体为质粒pWM101并携带有水稻矮缩病病毒复制酶基因Nib的提前终止突变体基因NibT,采用超声波处理花粉介导植物基因转化方法将NibT基因导入受体,经PCR检测和Southern杂交分析证实获得转基因植株,进而对T1～T3代转基因植株(株系)进行分子分析、田间抗病鉴定和农艺性状调查.逐代分子检测分析结果证明,目的基因可稳定遗传.抗病鉴定结果证明转基因植株(株系)各代抗病水平基本一致,抗病性比对照提高3级.农艺性状调查分析表明,与对照比较,转基因植株株高增加7～18 cm、穗位高增高0～13 cm、穗长增加0.7～2.1 cm、穗粒数多8～35粒、百粒重增加1.1～2.6 g,转基因株系与阴性对照间、各代转基因株系相互间都差异显著(P＜0.05);调查还发现转基因植株的株高和穗位高随着世代的增加,与对照间的差异逐代减少.研究也说明,超声波处理花粉介导植物基因转化方法是一种简捷、快速和有效的植物转化工具.     

超声波介导铁蛋白基因转化苹果的研究

以嘎拉苹果的叶片为转化受体,应用超声波法将菜豆铁蛋白基因导入受体中.实验表明,以0.5 W/cm2的声强、25℃、20 min超声波处理的转化效果最佳,抗性愈伤组织的比例高达24%.抗性愈伤组织经诱导获得了16个苹果抗性植株,有11株表现出GUS阳性,阳性比率为2.75%.经PCR检测,11株GUS阳性植株中有6株能扩增出目的条带;而Southern blotting实验表明,菜豆铁蛋白基因仅在2个苹果转基因株系的基因组中实现了完整插入,并且杂交的信号较强;进一步RT-PCR检测实验显示,外源菜豆铁蛋白基因在上述2株转基因植株中并未转录,发生了基因沉默.     

番茄红素β-环化酶基因的玉米转化及 后代遗传分析

利用农杆菌介导法将番茄红素β-环化酶基因(Lycb)转入由玉米自交系天塔五号植株,分析基因在T0转化及后代的遗传情况,结果表明,在27株T0转基因植株中,PCR初步检测后8株呈阳性;将T1代转基因植株以株系为单位用200mg/L草铵膦抗性筛选后,收获抗性植株种子。T2代转基因植株进一步进行PCR、RT-PCR和田间草铵膦涂抹检测,结果表明,PCR、RT-PCR为阳性的6个株系植株均具有草铵膦抗性。选取6株阳性植株提取叶片总类胡萝卜素,经HPLC分析其β-胡萝卜素含量显著高于野生型,表明目的基因Lycb成功的转入玉米,并得到了稳定遗传。     

转TPSP融合基因小麦的耐旱相关特性

在获得转TPSP基因小麦纯合株系的基础上,对3个转基因株系的耐旱相关生理特性进行了分析。脯氨酸含量测定显示,干旱胁迫过程中小麦叶片中脯氨酸含量逐渐增加,且3个转基因株系叶片中脯氨酸的积累速度和积累量均显著高于非转基因对照;叶绿素荧光参数测定显示,3个转基因株系的Fv/Fm值在胁迫过程中均略高于非转基因对照,转基因株系4-4-4的Fv/Fo值显著高于非转基因对照,表明转基因株系在水分胁迫条件下光合系统II（PSII）的光合效率有所增强;转基因小麦耐旱性鉴定显示：模拟干旱胁迫100h时对照小麦叶片几乎全部萎蔫,而3个转基因株系均表现出较强的耐旱性;复水24h后转基因株系4-9-1、4-4-4和30-1-2的叶片黄化率分别为25.2%、23.3%和27.6%,显著低于非转基因对照（48.8%）。上述研究结果表明转TPSP基因小麦具有较强的耐旱能力,为转基因材料进一步应用于小麦抗旱育种提供了依据。     

质粒DNA物理形态和其它因素对获得可育转基因小麦的影响

本工作分析了不同形态质粒DNA和未成熟胚高渗透压处理对基因枪小麦转化体系的适用性.高渗处理对瞬间表达和转基因小麦的再生均有明显的促进作用.轰击之前对质粒DNA进行变性处理导致瞬间表达反应大幅度下降,但稳定转化频率(指从100个轰击未成熟胚得到的再生可育转基因植株数)与双链DNA相差不大.使用单链质粒DNA、线性双链质粒DNA和环状双链质粒DNA均可以得到转基因小麦植株.迄今已得到26个不同的转基因冬小麦株系和4个不同的转基因春小麦株系.这些转基因小麦大多数已产生种子,几个春小麦株系已获第二代种子.     

质粒DNA物理形态和其它因素对获得可育转基因小麦的影响

The applicability of hyperosmotic treatment and different configurations of plasmid DNA for stable transformation of wheat mediated by particle bombardment was investigated. Hyperosmotic treatment increased the frequency of transient expression and had also a positive effect on stable transformation. Denaturation of plasmid DNA prior to bombardment led to dramatic reduction of transient expression. However, there were no marked differences between single-stranded and double-stranded DNA in stable transformation. Single-stranded plasmid DNA, double-stranded plasmid DNA in linear state and double-stranded plasmid DNA in circular state could all be used to produce transgenic wheat plants. A total of 26 independent transgenic plants of winter wheat genotype Florida and 4 independent transgenic plants of spring wheat genotype Veery were obtained. Most transgenic plants have set seeds. T2 seeds of some spring wheat transgenic plants have also been harvested.     

小麦春化相关基因的分子克隆与功能分析

小麦春化相关基因的分子克隆与功能分析@种康$中国科学院植物研究所!北京100093@许智宏$中国科学院植物研究所!北京100093@谭克辉$中国科学院植物研究所!北京100093小麦;;基因;;分子克隆     

农杆菌介导的半夏凝集素基因(Pinellia Ternate Agglutinin Gene,pta)对小麦的遗传转化及鉴定

以甘肃主要推广春小麦品种陇春22幼胚为转基因受体材料,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。以预培养4天的幼胚愈伤组织为受体,C58c1农杆菌菌株为供体,将含有半夏凝集素基因的重组质粒pBIpta转入了小麦,经G418 25 mg/L抗性筛选、PCR检测和荧光定量PCR检测共获得转基因植株3株,外源基因的插入拷贝数分别为2、1、3。同时对转基因小麦的T₁代植株进行了PCR检测和抗虫性分析,表明半夏凝集素基因在转基因植株的后代中得到了遗传并有一定的抗蚜虫作用。     

基因枪法获得无选择标记的1Dx5基因表达的转基因小麦

利用基因枪将无选择标记的优质高分子量麦谷蛋白亚基基因1Dx5导入新疆耐盐小麦品种新冬26,为利用优质基因进行小麦品质改良奠定基础。构建无选择标记的线性1Dx5表达框。利用基因枪将其转入不含该亚基的小麦品种新冬26幼胚盾片中,经PCR二分法筛选,从转化的1 000块幼胚盾片中共获得3株转基因阳性植株,转化效率0.3%。利用SDS-PAGE分析目的基因在转基因后代籽粒中的表达。转基因植株后代种子分析表明,1Dx5在转基因后代部分种子中表达。本研究成功地将无选择标记的线性1Dx5片段导入普通小麦新冬26中,并在后代部分种子中得到了表达。为利用优质亚基基因改良小麦加工品质奠定基础。     

转PvPGIP2基因小麦的获得与纹枯病抗性鉴定

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种植物防卫蛋白,可阻止一些病原真菌的侵害。本研究克隆出扁豆PvP-GIP2基因编码序列,构建了受玉米泛素(ubiquitin)启动子控制的PvPGIP2基因表达载体pA25-PvPGIP2;采用基因枪法将pA25-PvPGIP2转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4000块,获得了203株再生植株。PCR检测出阳性植株65株,转化率为1.625%。对转PvPGIP2基因小麦T1～T2植株,进行外源基因的PCR、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病抗性鉴定。结果表明,转入的PvPGIP2能够在转基因小麦中遗传、转录与表达;PvPGIP2基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病的抗性。     

Genetic transformation of wheat using mature seed tissues

A protocol for biolistic transformation of bread wheat based on using mature seed tissues as explants has been developed. Embryogenic callus obtained from mature seed tissues was transformed with a psGFP-BAR plasmid containing gfp reporter gene and bar selectable marker gene. The influence of hormone composition of the medium on the efficiency of transformation of mature wheat seed tissues has been demonstrated. The use of auxin 2,4-D resulted in the formation of transgenic plants with a frequency of 0.75%, while the use of Dicamba auxin for the regeneration of plants did not result in transformant development. The transgenic status of the plants obtained in the experiments has been confirmed by PCR and RT-PCR. Stable inheritance of transgenic features in the following generations of wheat (T₁, T₂) has been demonstrated and transgenic plants exhibiting high resistance to herbicides have been obtained. The protocol developed allows for a simplified transformation of wheat in order to obtain transgenic plants with novel features.     

农杆菌介导的大麦Mlo反义基因转化小麦获得抗白粉病后代

从大麦‘斯特林’幼叶总RNA中分离Mlo基因cDNA完整编码区,反向连接到植物双元载体（pBI-121.2）35S启动子下游,通过农杆菌介导的苗端转化法获得两种小麦基因型（‘烟优2801’和‘烟优361’）的转基因小麦。T0代405株中有55株PCR检测阳性,平均转化率达到13.58%,T0和T1基因组DNA Southern杂交可以证明大麦Mlo基因片段已整合到小麦基因组中并可传递到后代。两种基因型的转基因小麦T0和T1植株在温室及大田中均表现出对白粉病抗性的提高。农杆菌介导的苗端转化法可以简单、快速、高效地获得转基因株系;排除体细胞变异对转基因植株的影响;克服基因型对农杆菌转化的限制,是小麦遗传转化的一种实用方法。     

小麦抗白粉病相关基因的转化

利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因, 通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析, 优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是2个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的2个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中, 使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株, 进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株, 转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明, 外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性, 表现为延缓了白粉菌的发育。利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因,通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析,优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是两个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的两个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中,使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株,进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株,转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明,外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性,表现为延缓了白粉菌的发育。