利用酵母双杂交系统筛选与黄瓜花叶病毒外壳蛋白互作的寄主蛋白

利用酵母双杂交系统,以黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)为诱饵,从番茄叶片c DNA文库中筛选与其互作的蛋白。结果显示,诱饵载体pBT3-SUC-CMV-CP均能在酵母细胞中正确表达,无自激活活性而且对酵母无毒性;通过对酵母双杂交文库的筛选和回转验证,共获得了98个阳性克隆,分别编码67个可能与CMV-CP相互作用的蛋白,分别参与植物防御反应、光合作用、物质转运、信号转导、能量代谢、氨基酸代谢、细胞壁的形态建成、植物的激素代谢等。本研究结果表明,CMV CP可同时调控寄主的多个代谢过程,在CMV的致病过程中有多重功能。     

甘蔗花叶病毒P1基因的原核表达及其抗体制备

将扩增的甘蔗花叶病毒P1基因克隆到原核表达载体pET-32a上,转化BL21(DE3),获得重组子pET-32a-P1。超声波结果显示,所得的融合蛋白以可溶性的形式存在。SDS-PAGE检测其表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体。间接ELISA测定结果表明稀释51200倍仍呈阳性信号,并通过western blot检测,证明抗体特异性良好。     

我国大麦条纹花叶病毒的研究III．外壳蛋白氨基酸组成和N末端

将大麦条纹花叶病毒新疆分离物(BSMV-XJ),用CaCl2降解得到纯化的外壳蛋白。氨基酸组份分析表明,BSMV-XJ蛋白含16种氨基酸,其中天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸和精氨酸含量较高。不含胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定BSMV—XJ蛋白分子量为23×103o DNS-Cl法铡定其N端,证明是封闭的。     

甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因原核表达载体的构建与表达

目的:用原核表达的方法获取大量带6个His标记的甘蔗花叶病毒E株系(ScMV-E)外壳蛋白(CP)。方法:用带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的特异引物,以带有多个基因的重组质粒pNUSCP为模板,扩增出片段长度为942bp的ScMV-E外壳蛋白基因,亚克隆到pMD18-T载体上,转化E.coliDH5α,经双酶切检测获得阳性克隆。BamHⅠ和SalⅠ双酶切阳性克隆质粒,回收目的片段ScMV-E的CP基因。把目的片段插入表达载体pET29a( ),转化E.coliBL21(DE3),测序。结果:阳性质粒pET29a-CP在E.coliBL21(DE3)中得到大量特异表达。SDS-PAGE分析表明,该蛋白的相对分子质量约36000,与预测一致。结论:以上方法可以得到带6个His标记的目的蛋白,有利于纯化并获取高纯度的ScMV-E的外壳蛋白。     

甘蔗花叶病毒3‘末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV－CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaⅠ位点上,筛选得到多个重组质粒,选取其中一个克隆SCMV－CA54进行测序,得到一个全长为1296bp的苷酸序列,这段序列由一个长为1044bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279bp的3‘末端非编码区序列（3‘-UTR)及poly（A）尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白（b(NIb）基因序列,将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离的CP核苷酸序列的同源性介于63.7％－77.6％之间,氨基酸的同源性介于64％－89％之间。根据马玲薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV－CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系进分标准之间,这是我国首次报道SCMV CP基因序列。     

生物信息学分析人类病毒互作广谱蛋白的特征

了解病毒与人类蛋白的相互作用对于理解病毒感染宿主机制非常重要,已有研究主要集中在病毒如何进入宿主细胞、复制、扩散和致病等方向上,对病毒与人类蛋白的相互作用模式缺乏系统研究。本研究中我们构建了迄今为止最全面的病毒与人类之间的蛋白相互作用网络,涵盖来自218种病毒的1 674种蛋白与来自人类的13 724种蛋白的108 832对蛋白相互作用;在此基础上鉴定出109个至少与12种病毒家族存在蛋白相互作用的人类蛋白,定义为人类的病毒互作广谱蛋白（简称广谱蛋白）;从结构、功能、蛋白互作网络以及组织表达量等四个方面系统地分析了广谱蛋白的特征,发现广谱蛋白相较于非广谱蛋白以及其它人类蛋白具有更密集的转角结构、更多的结构域、更高的网络中心度和组织表达量,表明它们可能在病毒感染宿主过程中起着重要作用。本研究有助于加深我们对于病毒感染人类模式的理解,同时也对进一步探究病毒与疾病之间的关联有一定的帮助。     

运用BioID技术筛选水稻GS3互作蛋白

水稻异源三聚体G蛋白系统中的非典型γ亚基GS3,是一个控制籽粒大小的主效数量效应基因座,在调节籽粒大小中发挥负调控因子的功能。BioID(proximity-dependent biotin identification)为邻近蛋白标记技术,其工作原理是生物素连接酶能使其周围的蛋白带上生物素,同时生物素又能和链霉亲和素紧密结合,所以能够利用链霉亲和素偶联的磁珠富集目标蛋白。该技术具有灵敏、高效和周期短等特点,为筛选互作蛋白提供了新方法。为了解析GS3的蛋白调控网络,该研究以水稻原生质体为材料,采用BioID技术对GS3在水稻中的互作蛋白进行了筛选。Western-blot结果表明:融合蛋白Bir AG-GS3在原生质体中成功表达并生物素化GS3邻近蛋白。使用链霉亲和素磁珠富集生物素化后的蛋白,并进行蛋白质谱测序,获得了与GS3邻近的可能存在直接或间接互作的蛋白。将获得的蛋白进行功能富集与注释,并构建蛋白-蛋白互作网络。对部分蛋白进行了BiFC验证,发现GS3可能与ICL、PPDK、RPN7和RH15发生相互作用,涉及能量代谢的调节、种子淀粉物质的储存、泛素-蛋白酶体系统以及凋亡途径等生物过程。     

由高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒引发的浙江甘蔗花叶病害

从浙江省5个地区采集表现花叶症状的甘蔗病叶,用马铃薯Y病毒科简并引物做PCR扩增及测序鉴定.序列分析表明,5个甘蔗样品均含有高粱花叶病毒(SrMV),其中3个样品中还存在甘蔗花叶病毒(SCMV)的复合侵染.序列比较和系统进化树分析表明,浙江甘蔗样品中的SrMV序列彼此很相似,核苷酸同源性大于93%,与已报道的4个美国分离物在CP区域同源性很高,但是3′非编码区的同源性却仅为70%左右.SCMV欧洲和中国玉米分离物及美国、南非和澳大利亚甘蔗分离物分别形成两个远缘群体,浙江甘蔗分离物群体位于两者之间;群体间CP氨基酸序列同源性均大于80%.甘蔗和玉米上的SCMV差异明显,多为无义突变.     

甘蔗花叶病毒3’末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV-CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaI位点上,筛选得到多个重组质粒。选取其中一个克隆SCMV-CA54进行测序,得到一个全长为1296 bp的核苷酸序列。这段序列由一个长为1044 bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279 bp的3’末端非编码区序列（3'-UTR）及poly(A)尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白b（NIb）基因序列。将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离物CP核苷酸序列的同源性介于63.7%～77.6%之间,氨基酸的同源性介于64%～89%之间。根据马铃薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV-CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系划分标准之间。这是我国首次报道SCMVCP基因序列。     

大麦条纹花叶病毒新疆株3'端基因组的克隆及分析

我们应用多次加尾的方法,对大麦条纹花叶病毒新疆株的RNAs基因组进行克隆。在所述条件下可以合成2000～3000核苷酸长度的cDNA。通过原位杂交、转印杂交(Northern blot)证明所得克隆属于RNA_1和RNA_3组分,并包含有3′端基因组结构。对部分克隆进行了酶谱分析。     

马铃薯Y病毒属病毒P3和P3-PiPo蛋白功能研究进展

Potyvirus属于马铃薯Y病毒科Potyviridae,是最大的植物病毒属,给农业生产造成严重的经济损失。P3是Potyvirus属病毒中变异很大、功能较复杂的编码蛋白,涉及到病毒复制、侵染、抗性及细胞间运动;P3-PiPo是P3编码框内新近发现的Potyvirus重要编码蛋白,已证实它在病毒的细胞间运动中起着决定性的作用。对病毒蛋白功能的研究为该属病毒的研究发展提供重要的理论基础,对Potyvirus侵染机制及抗病机理研究具有指导价值。     

朊蛋白与信号蛋白14-3-3β的相互作用研究

为进一步确定PrP蛋白与14-3-3蛋白是否发生分子间的相互作用并确定PrP蛋白与14-3-3蛋白相互作用的区域,利用免疫共沉淀、pull down和能量共振转移(FRET)实验检测PrP蛋白与人14-3-3蛋白是否发生分子间的相互作用及相互作用的部位。结果证明,PrP蛋白与人14-3-3蛋白在体外、组织水平及细胞水平均可以发生相互作用,且证实作用的部位在PrP蛋白的106-126位氨基酸。该结果为进一步研究14-3-3蛋白在Prion疾病中的影响及Prion疾病的发病机制奠定了一定基础。     

Electrostatic fields at the active site of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase.

A macroscopic approach has been employed to calculate the electrostatic potential field of nonactivated ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase and of some complexes of the enzyme with activator and substrate. The overall electrostatic field of the L2-type enzyme from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum shows that the core of the dimer, consisting of the two C-terminal domains, has a predominantly positive potential. These domains provide the binding sites for the negatively charged phosphate groups of the substrate. The two N-terminal domains have mainly negative potential. At the active site situated between the C-terminal domain of one subunit and the N-terminal domain of the second subunit, a large potential gradient at the substrate binding site is found. This might be important for polarization of chemical bonds of the substrate and the movement of protons during catalysis. The immediate surroundings of the activator lysine, K191, provide a positive potential area which might cause the pK value for this residue to be lowered. This observation suggests that the electrostatic field at the active site is responsible for the specific carbamylation of the epsilon-amino group of this lysine side chain during activation. Activation causes a shift in the electrostatic potential at the position of K166 to more positive values, which is reflected in the unusually low pK of K166 in the activated enzyme species. The overall shape of the electrostatic potential field in the L2 building block of the L8S8-type Rubisco from spinach is, despite only 30% amino acid homology for the L-chains, strikingly similar to that of the L2-type Rubisco from Rhodospirillum rubrum. A significant difference between the two species is that the potential is in general more positive in the higher plant Rubisco. In particular, the second phosphate binding site has a considerably more positive potential, which might be responsible for the higher affinity for the substrate of L8S8-type enzymes. The higher potential at this site might be due to two remote histidine residues, which are conserved in the plant enzymes.     

Constitutively and autonomously active protein kinase C associated with 14-3-3 zeta in the rodent brain

Persistent activation of protein kinase C (PKC) is required for the expression of synaptic plasticity in the brain. There are several mechanisms proposed that can lead to the prolonged activation of PKC. These include long lasting production of lipid activators (diacylglycerol and fatty acid) through mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway, and a modification of PKC by reactive oxygen species. In nerve growth factor (NGF)-differentiated PC12 cells, we found that constitutive and autonomous Ca2+-independent PKC activity is associated with 14-3-3 zeta. Because PKC and 14-3-3 zeta are both involved in synaptic plasticity and learning and memory, we examined whether PKC interacts with 14-3-3 zeta in the brain and whether the PKC/14-3-3 zeta complex has autonomous activity. Here we show that three subclasses of PKC, Ca2+-dependent classical PKC, Ca2+-independent novel PKC, and Ca2+-independent and diacylglycerol-insensitive atypical PKC, all interact with 14-3-3 zeta in the rodent brain. The pool size of 14-3-3 zeta bound form of PKC is small (1-4% of each PKC isoform), but they show constitutive and autonomous activity. Our study indicates that the binding of PKC with 14-3-3 zeta is at least in part independent of phosphorylation of PKC and that the C1 domain of PKC is involved in the binding. As both molecules are enriched in synaptic locus, the constitutive PKC activity and its interaction with 14-3-3 zeta could be a mechanism for the persistent PKC activation in the brain.     

植物叶片中Rubisco含量的免疫沉淀法测定

Rubisco为光合生物中的关键性酶,对光合作用起重要的调节作用,Rubisco又是植物中重要的氮源贮藏物质。因而Ｒu-bisco的定量测定十分重要,以扬麦为实验材料,提取,纯化Ｒubisco,再以纯化的Ｒubisco为抗原制备Ｒubisco抗体,利用所得抗体采用免疫沉淀技术测定不同植物中的Ｒubisco含量,为Ｒubisco的准确定量测定提供了较简便,快速的方法。     

Conformations of P2 Protein of Peripheral Nerve Myelin by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

High-resolution 1H NMR spectra of P2 protein from bovine peripheral nerve myelin indicate that the protein contains a high degree of tertiary structure in aqueous solution. Denaturation of the protein in urea solutions is a multi-step process. Binding of lysophosphatidylcholine micelles to the protein causes a conformational change and a broadening of NMR peaks from side chains of aromatic amino acid and methionine residues, with much less effect on upfield methyl resonances.