稻纵卷叶螟几丁质合成酶及合成通路相关酶基因的鉴定及表达分析

【目的】稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenee)是水稻上的四大害虫之一,危害较为严重,近年来以几丁质合成和代谢过程作为害虫防治的标靶研究已成为热点。为阐明几丁质合成酶及合成通路上关键酶的作用,本研究开展了对稻纵卷叶螟几丁质合成酶及合成相关通路上关键酶的克隆及时空表达分析。【方法】本研究基于稻纵卷叶螟转录组,结合PCR及RACE技术,克隆了几丁质合成酶代谢通路上的4条基因的c DNA全长;利用生物信息学软件对序列进行结构预测、序列比对和进化分析;采用实时定量PCR技术研究了4条基因在不同虫态和幼虫的不同组织中的表达情况。【结果】获得了2条几丁质合成酶序列及2条合成通路上的基因序列,包括几丁质合成酶A(Chitin synthase A,CHSA),几丁质合成酶B(Chitin synthase B,CHSB),N-乙酰葡糖胺磷酸变位酶(Phosphoacetylglucosamine mutase,PGM和UDP-N-乙酰葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase,UAP),并分别命名为Cm CHSA、Cm CHSB、Cm PGM和Cm UAP;序列分析显示Cm CHSA序列全长4 868 bp,编码1 564个氨基酸。Cm CHSB序列全长4 651 bp,编码1 525个氨基酸。Cm PGM全长1 934 bp,编码548个氨基酸。Cm UAP序列全长1 837 bp,编码487个氨基酸。实时定量研究表明,Cm UAP和Cm PGM在血淋巴中表达量最高,Cm CHSA在头部和表皮中表达量较高,而Cm CHSB在中肠中表达量最高。【结论】本研究得到了稻纵卷叶螟几丁质合成路径的4个关键酶基因c DNA全长,它们在稻纵卷叶螟的不同组织和虫态中呈现了差异显著的时空表达,本文为进一步探究稻纵卷叶螟的几丁质合成酶的生理功能和几丁质的合成代谢途径奠定了基础。     

梨小食心虫几丁质合成酶1基因的克隆与表达分析

【目的】克隆梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)几丁质合成酶1基因,分析该基因的分子特征及时空表达模式,为探析其生理功能奠定基础。【方法】利用简并引物和RACE技术从梨小食心虫5龄幼虫和蛹中克隆几丁质合成酶1基因的全长c DNA序列,同时获得其两个可变剪切外显子序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统进化树。利用RTq PCR技术研究该基因及两个可变剪切外显子在1日龄预蛹不同组织(头、体壁、脂肪体、中肠、气管和马氏管)中以及不同发育阶段(2-5龄幼虫、预蛹、蛹和成虫)的表达特性。【结果】克隆获得梨小食心虫几丁质合成酶1基因,将其命名为Gm CHS1,该基因编码1 565个氨基酸,包含了16个跨膜螺旋,两个可变剪切外显子包含177个碱基,编码59个氨基酸序列,分别命名为Gm CHS1a(Gen Bank登录号:MF000781)和Gm CHS1b(Gen Bank登录号:MF000782)。系统发育树同源分析结果表明,Gm CHS1属于几丁质合成酶1,Gm CHS1a和Gm CHS1b分别归属于可变剪切外显子CHS1a和CHS1b。组织表达模式表明,Gm CHS1基因在体壁中表达量最高,其次是在头和气管中,其余组织中表达量较低或不表达;发育表达模式表明,该基因在各个发育阶段均有表达,幼虫蜕皮期、预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中表达量上调。Gm CHS1a在体壁和头部的表达量高于Gm CHS1b,而在气管和脂肪体中的表达量略低于Gm CHS1b,两者在中肠和马氏管中表达量都很低。在梨小食心虫不同发育阶段,Gm CHS1a的表达趋势表现为在幼虫蜕皮和预蛹-蛹转变过程中高表达;Gm CHS1b在幼虫各个阶段表达量都较低,在预蛹-蛹和蛹-成虫转变过程中高表达。【结论】Gm CHS1a和Gm CHS1b属于昆虫几丁质合成酶1家族,其基因在梨小食心虫不同组织及发育阶段的表达量显著不同,推测其在梨小食心虫发育过程中发挥着不同的作用。本研究为进一步探索该基因在梨小食心虫体内的功能奠定了基础。     

柑橘全爪螨热激蛋白基因PcHsp90的克隆及表达模式分析

【目的】研究热激蛋白基因Hsp90在柑橘全爪螨Panonychus citri生长发育及响应高温和低温胁迫方面的作用。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆柑橘全爪螨Hsp90基因cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因的序列特性;运用荧光Real-time PCR技术,分析Hsp90基因mRNA在该螨各发育阶段、高温及低温胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆鉴定出柑橘全爪螨一条Hsp90基因的c DNA全长序列,命名为PcHsp90(Gen Bank登录号:GQ495086),全长为2 763 bp,包含2 193 bp的开放阅读框,编码730个氨基酸,编码蛋白质的理论分子量和等电点分别为83.85kDa和4.99,氨基酸序列包括Hsp90家族的5个特征基序及细胞质型Hsp90的特征序列"MEEVD"。系统进化分析表明,PcHsp90与朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus的Hsp90首先聚为一支,然后再与肩突硬蜱Ixodes scapularis的Hsp90聚合,说明它们较近的亲缘关系。PcHsp90在柑橘全爪螨的各发育阶段均有所表达,其中在幼螨期表达量较低,且显著低于若螨和成螨期的表达水平(P=0.015)。0~10℃低温胁迫下,Pc Hsp90的mRNA相对表达量无显著变化(P=0.492);但在35~41℃高温胁迫下,Pc Hsp90的mRNA相对表达量随胁迫温度的升高而上调,尤其是当温度升高到41℃时,mRNA相对表达量达到对照(25℃)的6.75倍,且差异达显著水平(P=0.007)。【结论】柑橘全爪螨PcHsp90不仅对该螨的生长发育具有重要作用,而且是其响应高温胁迫的重要机制之一。     

二斑叶螨抗螺螨酯品系GST基因的克隆与表达分析

【目的】揭示二斑叶螨Tetranychus urticae对螺螨酯的分子抗性机理。【方法】利用RT-PCR克隆了二斑叶螨的谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase, GST)基因 cDNA 全长序列, 采用生物信息学软件分析了克隆基因的编码蛋白特性; 利用实时荧光定量PCR 方法分析GST基因在二斑叶螨的螺螨酯抗性与敏感品系中的表达差异。【结果】克隆获得的谷胱甘肽-S-转移酶2个基因分别被命名为TuGSTd1和TuGSTd2 (GenBank登录号分别为： KC445659和KC445660)。序列分析发现, TuGSTd1的开放阅读框长度为648 bp, 编码215个氨基酸, 分子量约为24.47 kDa, 理论等电点为5.49; TuGSTd2的开放阅读框为648 bp, 编码215个氨基酸, 分子量约为24.57 kDa, 理论等电点为6.33。系统发育分析表明这两个基因与桔全爪螨Panonychus citri Delta家族的GST基因的氨基酸序列一致性为93%。实时荧光定量PCR 结果表明, TuGSTd1和TuGSTd2在二斑叶螨抗螺螨酯品系中的相对表达量分别为敏感品系的5.60和3.75 倍。【结论】 GST基因在二斑叶螨抗螺螨酯品系中的相对表达量均显著高于敏感品系, 据此推测GST基因的过量表达可能与其对螺螨酯的抗性形成有关。     

梨小食心虫几丁质合成酶2基因的克隆与表达研究

【目的】研究梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)几丁质合成酶2(GmCHS2)基因序列和表达特性,为进一步研究其功能及新型杀虫剂的开发提供理论依据。【方法】利用转录组数据和RACE技术首次获得GmCHS2基因cDNA序列(命名为GmCHS2,GenBank登录号为KY242360),利用其他昆虫同源序列构建系统发育树,利用实时荧光定量PCR技术研究GmCHS2在不同发育阶段和不同组织的表达特性。【结果】GmCHS2基因序列全长4991bp,开放阅读框为4554bp,其中5′端非编码区长267bp,3′端非编码区长170bp,共编码1517个氨基酸,包含了14个跨膜螺旋。系统发育树结果表明该基因属于几丁质合成酶2类基因。GmCHS2基因在试虫不同发育阶段都有表达,预蛹期和成虫期表达量最高;不同组织中,前肠和中肠的表达量最高,其次是后肠,其余组织表达量很少或不表达。【结论】本文研究了GmCHS2基因在梨小食心虫不同发育阶段和组织部位的表达特性,该基因可能在梨小食心虫生长发育过程中具有重要作用。     

朱砂叶螨硒代谢通路基因筛选及硒磷酸合成酶 TcSPS1的原核表达和特性分析

【目的】本研究旨在筛选朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus硒代谢通路的关键基因,探究其在朱砂叶螨硒代谢中的功能。【方法】使用基因克隆技术对8条朱砂叶螨硒代谢通路基因进行克隆;利用qPCR技术检测这些基因在不同浓度(0, 5, 20和50 μmol/L)亚硒酸钠(Na₂SeO₃)处理的豇豆苗上饲养3 d的朱砂叶螨品系(短期硒饲养品系)雌成虫间以及朱砂叶螨普通品系(豇豆苗饲养)和长期硒饲养品系(20 μmol/L Na₂SeO₃处理的豇豆苗饲养超1年)雌成虫间的表达量差异,并分析它们对硒诱导的表达响应;原核表达差异表达基因TcSPS1,并测定获得的重组蛋白生化特性。【结果】成功克隆了朱砂叶螨硒代谢通路的8条基因TcTxnrd1, TcTxnrd2, TcSPS1, TcSPS2, TcSPS2-1, TcSPS2-2, TcSG和TcPSTK。qPCR结果表明TcSPS1和TcTxnrd2在短期硒饲养和长期硒饲养朱砂叶螨品系中均上调表达,且TcSPS1的表达量变化与硒浓度变化密切相关。原核表达系统成功获得TcSPS1可溶性重组蛋白,测得其重组蛋白比活力为2.366±0.046 nmol/mg pro·min,K_m和V_max值分别为10.054±0.062 μmol/L和29.633±1.777 nmol/mg pro·min。【结论】通过硒代谢通路基因分析,初步解释了朱砂叶螨对硒的适应的分子机制,并证明了上调表达的TcSPS1基因在朱砂叶螨产生对硒的适应中起着重要的功能。     

蜕皮激素和有效霉素对粘虫几丁质合成酶B基因表达的影响

【目的】克隆粘虫Mythimnaseparata几丁质合成酶B基因的全长cDNA序列,研究该基因的时空表达特性,分析蜕皮激素(20-hydroxy ecdysone, 20 E)和有效霉素(Validamycin)对该基因表达水平的影响。【方法】本试验通过高通量测序法获得粘虫几丁质合成酶B基因的cDNA全长序列,利用RT-qPCR技术分析粘虫几丁质合成酶B基因在不同发育阶段和不同组织的特异性表达及蜕皮激素和有效霉素对其表达的影响。【结果】基因cDNA全长4 617 bp,包含一个完整开放阅读框,编码1个1 538个氨基酸组成的多肽,分子量为175.629 ku,理论等电点为5.96,包含17个跨膜螺旋,4个几丁质合成酶的标签序列CATMWHET,DGD,EDR和QRRRW及1个催化结构域。该基因命名为MsCHSB,GenBank登录号为KY348776。氨基酸序列比对表明,该基因与其他昆虫的几丁质合成酶B基因同源性高于52%,其中与蓓带夜蛾Mamestra configurata和棉铃虫Helicoverpa armigera的几丁质合成酶B基因同源性最高,分别为92%和83%。RT-qPCR技术表明粘虫在不同发育阶段和组织中均有mRNA的特异性表达,其中3龄第1天和中肠中MsCHSB基因相对表达量最高。注射10μg/μL浓度的蜕皮激素6 h和12 h后,表现为对该基因的诱导效应,与对照组差异显著;有效霉素处理后该基因相对表达量均被显著抑制,其中注射20μg/μL浓度的有效霉素48h后,抑制作用最为明显。【结论】本试验得到了一条新的粘虫几丁质合成酶B基因cDNA序列全长。蜕皮激素对MsCHSB基因的表达有一定的诱导作用,有效霉素对MsCHSB基因的表达有一定的抑制作用,该结果为进一步研究昆虫几丁质合成酶B打下了基础。     

百合查尔酮合成酶基因的克隆与分析

以西伯利亚百合为试材,通过半巢式PCR和RT-PCR技术分别克隆了查尔酮合成酶基因(CHS)的DNA和cDNA.生物信息学分析显示,CHS的DNA序列全长1 397 bp(登录号HM622754),包含2个外显子和1个内含子;cDNA序列编码区全长1 182 bp(登录号HQ161731),编码393个氨基酸,具有3个典型的CHS蛋白结构域:N-末端结构域(Lys3-Pro229)、C-末端结构域(Gln239-Pro389)和聚合酶Ⅲ结构域(Met1-Thr391);不同百合品种的CHS基因编码的氨基酸序列相似性高达98%,表明百合CHS基因在进化上呈现出十分保守的趋势;不同植物CHS基因序列的系统进化邻接树结果表明:百合与单子叶植物鸢尾及禾本科的水稻、大麦、玉米等亲缘关系更为接近.     

白背飞虱几丁质合成酶1基因的结构及特性研究

几丁质合成酶1(CHS1)是昆虫几丁质合成的关键酶,在昆虫几丁质合成的组织中发挥着重要作用。为探索白背飞虱Sogota furcifera几丁质合成酶1(Sf CHS1)的基因结构特征及其功能,利用转录组测序结合PCR扩增技术,研究了Sf CHS1基因的结构特性,采用定量PCR技术研究Sf CHS1基因的时空表达特性,最后利用显微注射RNAi方法研究Sf CHS1基因的RNAi效果。通过转录组测序获得的Sf CHS1基因开放阅读框为4 719 bp,编码1572个氨基酸,预测蛋白分子量为180.6 k D,预测有6个糖基化位点和16个跨膜螺旋。PCR扩增及测序结果表明Sf CHS1基因存在两个可变剪切,产生两个转录本(CHS1a和CHS1b)。通过系统进化树分析,Sf CHS1和灰飞虱Laodelphgax striatellus及褐飞虱Nilaparvata lugens的CHS1同源性最高,为97%。时间表达特异性分析结果表明,Sf CHS1基因在4龄期第1天,5龄期第1天,成虫第1天即几丁质合成时的表达量最高。组织特异性检测结果表明,Sf CHS1基因主要在白背飞虱的表皮中表达,其次为气管,在肠中也有少量表达。显微注射RNAi的结果表明该方法能显著降低Sf CHS1基因的转录水平,并导致白背飞虱的死亡。研究结果说明,Sf CHS1基因具有两个可变外显子结构,Sf CHS1基因在几丁质合成阶段及几丁质含量高的组织表达量较高,沉默Sf CHS1基因的表达会对白背飞虱产生致死的表型,出现较高的死亡率。     

水蕨(Ceratopteris thalictroides)查尔酮合成酶基因的克隆和表达（英文）

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮化合物合成的关键酶,有关蕨类植物CHS基因的序列及功能信息尚不完善。本研究采用快速扩增c DNA末端(RACE)技术克隆获得了模式蕨类植物——水蕨(Ceratopteris thalictroides)Ct CHS基因(Gen Bank登录号:JX027616.1),其c DNA序列全长为1616 bp,具有3个外显子和2个内含子,开放阅读框(ORF)为1215 bp,编码404个氨基酸。进化树分析表明,Ct CHS与问荆(Equisetum arvense)、松叶蕨(Psilotum nudum)和3种薄囊蕨的查尔酮合成酶基因聚为一枝,说明这些蕨类植物亲缘关系较近且为单系起源。通过构建原核表达体系成功获得Ct CHS蛋白的多克隆抗体并用于免疫印迹分析,结果表明Ct CHS基因的表达明显受紫外光(UV)诱导。Ct CHS基因的克隆与表达分析为进一步研究水蕨类黄酮化合物的合成及其调控机制提供了依据。     

Entwicklungsgeschichte und Ultrastruktur von Pollenkitt und Exine bei nahe verwandten entomophilen und anemophilen Angiospermensippen derAlismataceae,Liliaceae, Juncaceae,Cyperaceae, Poaceae undAraceae

Some closely related members of the monocotyledonous familiesAlismataceae, Liliaceae, Juncaceae, Cyperaceae, Poaceae andAraceae with variable modes of pollination (insect- and wind-pollination) were studied in relation to the ultrastructure of pollenkitt and exine (amount, consistency and distribution of pollenkitt on the surface of pollen grains). The character syndromes of pollen cementing in entomophilous, anemophilous and intermediate (ambophilous or amphiphilous) monocotyledons are the same in principal as in dicotyledons. Comparing present with former results one can summarize: 1) The pollenkitt is always produced in the same manner by the anther tapetum in all angiosperm sub-classes. 2) The variable stickiness of entomophilous and anemophilous pollen always depends on the particular distribution and consistency of the pollenkitt, but not its amount on the pollen surface. 3) The mostly dry and powdery pollen of anemophilous plants always contains a variable amount of inactive pollenkitt in its exine cavities. 4) A step-by step change of the pollen cementing syndrome can be observed from entomophily towards anemophily. 5) From the omnipresence of pollenkitt in all wind-pollinated angiosperms studied one can conclude that the ancestors of anemophilous angiosperms probably have been zoophilous (i.e. entomophilous) throughout.

     

Identification and Characterization of the First Equine Parainfluenza Virus 5

正Dear Editor,Parainfluenza virus 5 (PIV5), known as canine parainfluenza virus in the veterinary field, is a negative-sense,nonsegmented, single-stranded RNA virus belonging to the Paramyxoviridae family (Chen 2018). The virus was first reported in primary monkey kidney cells in 1954 (Hsiung1972), then it has been frequently discovered in various     

Pathogenic Characterization and Full Length Genome Sequence of a Reassortant Infectious Bursal Disease Virus Newly Isolated in Pakistan

<正>Dear Editor,Infectious bursal disease (IBD) is one of the most important diseases of the poultry. The IBD virus (IBDV), a nonenveloped virus belonging to the Birnaviridae family with a genome consisting of two segments of double-stranded RNA (segments A and B), targets B lymphocytes of bursa of Fabricious leading to immunosuppression. In Pakistan,poultry farming is the second biggest industry and IBD is the second biggest disease threating the poultry sector.However, there is limited genome information of IBDV