高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸（GLA）作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3.5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱质谱（GC-MS）联用分析表明高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16.26%。     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达

以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,将质粒pRH2304转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析,荧光显微观察结果表明GFP在YM25235获得表达,建立了红冬孢酵母YM25235遗传转化方法。在此基础上,以高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因取代pRH2304中的GFP基因,构建重组质粒pRH2304MAD6,将其转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析。PCR结果表明,高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已经整合到YM25235基因组中,进一步的脂肪酸气相色谱分析结果表明,该基因编码产物催化n-6途径中的亚油酸转化成γ-亚麻酸,占细胞总脂肪酸的4.35%,但没有检测到催化n-3途径中的α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸。     

高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

△^6－脂肪酸脱氢酶基因是形成γ－亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6－脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC－Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC－MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6％的γ－亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6－脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌△^6 -脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉（Thamnidium elegans）As3．2806△^6 -脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术（RACE）向两端延伸得到1504bp的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的△^6 -脂肪酸脱氧酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSel的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSel中异源表达。通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸（GLA）的含量占酵母总脂肪酸的7．5％。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因（GenBank．AY941161）。     

卷枝毛霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

为获得产高γ—亚麻酸的酿酒酵母工程菌株,应用RT—PCR技术,从卷枝毛霉中扩增出△^6—脂肪酸脱氢酶基因,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2．0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYES412,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScl中,在SC—ura合成培养基中筛选到转化酵母,在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过气相色谱对转化酵母进行脂肪酸色谱分析,结果表明：γ—亚麻酸占总脂肪的50．07％。迄今为止,这是国内外△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母表达量最高的报道。     

少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

Δ^6-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ^6-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ^6-肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因（RAD6）亚克隆到表达载体pPIC3．5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱-质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16：1、C17：1、C18：1、亚油酸和α-亚麻酸在△6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因的功能。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（GLA,C18：3△^6,9,12）是由△^6-脂肪酸脱氢酶以亚油酸（LA,C18：2△^9,12)为底物,在C6位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△^6-脂肪酸脱氢酶的cDNA,全长为1374个核苷酸,编码457个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,△^6-脂肪酸脱氢酶在其序列的N端特有细胞色素b5(Cytb5)区。这是国际上对深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生r-亚麻酸,从深黄被孢霉中克隆的△^6-脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pB1121连接,构建了重组质粒pBMICL-6,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导人到栽培大豆吉林35、吉林43、吉林47、绥农10、绥农14和黑农37等品种中,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导人并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析,结果表明△。-脂肪酸脱氢酶基因获得表达,产生了r-亚麻酸,其含量最高可达27．067％,这是国内外深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中表达的首次报道。     

少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

△6-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶.在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码△6-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的△6-脂肪酸脱氢酶基因.把少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达.提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱-质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16:1、C17:1、C18:1、亚油酸和α-亚麻酸在△6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性.此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平.综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析△6-脂肪酸脱氢酶基因的功能.     

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）As 3.38△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆与酵母表达

通过气相色谱法(GC)快速分析8种真菌的脂肪酸成分,发现匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)具有较高的γ-亚麻酸含量,利用RT-PCR和RACE方法获得了全长为1475bp的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列,其中开放阅读框为1380bp,编码459个氨基酸。生物信息学分析所克隆的基因具有△6-脂肪酸脱氢酶的典型结构:N端具有细胞色素b5结构、具有3个保守的组氨酸区序列和跨膜结构;把该基因的开放阅读框序列连接到表达载体pYES2.0上,构建重组表达载体pYRnD6D,并将其转入缺陷型酿酒酵母INVScl中进行表达。GC分析表明,该序列在酵母中获得了表达,表达产物表现出△6-脂肪酸脱氢酶的酶学活性,能将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸。新生成的γ-亚麻酸占酵母细胞总脂肪酸的12.25%。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因在转基因烟草中的表达

γ—亚麻酸(GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸,在大多数油料作物种子中不含有GLA,而只含有其前体物亚油酸,只有少数油料植物种子中含有GLA,如夜来香(Oenothera spp),琉璃苣(Borago officinalis)等。△^6—脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ—亚麻酸,为了能够在传统的油料作物种子中产生GLA,我们将从深黄被孢霉中克隆的△^6—脂肪酸脱氢酶基因,与植物表达载体pGA643连接,构建了重组质粒pGAM—ICL6,将其通过农杆菌介导法,导入模式植物烟草中。经PCR和Southern杂交分析表明该基因已导入并整合到烟草的基因组中,Northern杂交结果表明该基因在转基因烟草的mRNA水平上获得表达。对转基因植株进行脂肪酸分析,结果显示,GLA和十八碳四烯酸(OTA)分别占总脂肪酸含量的19．7％和3．5％。     

△6-脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究进展

包括γ-亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸由于在人类健康中的重要作用而成为有价值的产品,目前市场上对γ-亚麻酸的需求持续增长,然而当前来源难以满足市场的需求,寻找合适的替代来源将有助于解决这一问题。△^6-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶,这里从△^6-脂肪酸脱氢酶的基因克隆、结构和功能的研究、系统进化和基因工程应用等方面探讨了△^6-脂肪酸脱氢酶的研究进展。     

利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列

用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As3.2806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。     

Differential expression of desaturases and changes in fatty acid composition during sporangiospore germination and development in Mucor rouxii

Polyunsaturated fatty acids (PUFAs), namely, oleic (C18:1), linoleic (C18:2), and gamma-linolenic acid (C18:3), constituted the majority in the total fatty acid content (44%) of sporangiospores of Mucor rouxii. At 30 degrees C, the germination begins within 1h at which time spore swelling occurs, followed by germ tube emergence within 3-4h. Throughout germination, an increase in gamma-linolenic acid (GLA) was observed and its content was highest at germ tube emergence. It took longer for sporangiospores of M. rouxii to germinate at sub-optimal temperatures (15 and 35 degrees C). However, the content of GLA was higher at the germ tube initiation than at the mycelial stage at all temperatures, suggesting the association of GLA and germination of sporangiospores. This finding was substantially confirmed by differential expression of delta9-, delta12-, and delta6-desaturase genes measured during spore germination. The expression of three desaturase genes parallels the pattern of GLA synthesis. By using RT-PCR techniques to follow gene expression, we found that mRNA of delta12- and delta6-desaturase genes were translated as soon as the spores were introduced into a fresh medium while the mRNA of delta9-desaturase gene could not be detected until 2h after introduction. A sharp increase in mRNA of delta6-desaturase genes correlated well with an increase in GLA content at germ tube emergence (4h). These results demonstrated that changes in fatty acid composition of sporangiospore of M. rouxii and differential expression of desaturase genes occurred during germination, and that extensive changes in GLA synthesis associated with some events in germination process.     

小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

Δ8途径是合成多不饱和脂肪酸的替代途径,Δ8-脂肪酸脱氢酶是该途径的关键酶之一。根据已报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从小眼虫藻基因组DNA和cDNA中扩增得到该基因片段,序列分析表明：结构基因长1 266 bp,编码421个氨基酸;该基因没有内含子,比已经报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因长6 bp,并且N末端序列也有所不同。利用酿酒酵母的载体pYES2.0构建Δ8-脂肪酸脱氢酶表达载体pYEFD,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在选择培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YD8。YD8在合适的培养条件下,添加外源底物二十碳二烯酸和二十碳三烯酸并诱导基因表达。脂肪酸甲酯气相色谱分析表明小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效表达,将二十碳二烯酸和二十碳三烯酸分别转化成二高-γ-亚麻酸和二十碳四烯酸,其底物转化率分别达到了31.2％和46.3％。