红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD8基因的克隆与诱导表达

探讨红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD8基因的基本特性。应用同源克隆和cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了红笛鲷CD8α和CD8β基因,并分析了其在不同组织的表达分布及免疫刺激物诱导后的表达模式。结果显示,CD8αcDNA序列全长1 576 bp,编码225个氨基酸。红笛鲷CD8β基因cDNA序列全长为1 486 bp,编码210个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示,CD8α和CD8β均由信号肽、免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily,Ig SF)可变区、铰链区、跨膜区和胞浆区组成。荧光定量PCR(Real time quantitative PCR,q RT-PCR)分析显示红笛鲷CD8α和CD8β基因在胸腺表达量最高,其次为中肾、鳃、肠、皮肤、脾和头肾。红笛鲷头肾淋巴细胞体外经LPS、ConA和PolyI:C刺激8 h后CD8α和CD8β表达量显著上调(P0.01)。哈维氏弧菌疫苗刺激24 h后鳃、头肾、脾脏、和肠的表达量上升。     

红笛鲷Integrin-β基因的克隆及表达分析

为了探讨鱼类Integrin-β的组织分布及其在病原刺激后的表达模式,本研究以中国南方主要海水养殖品种-红笛鲷为研究对象,根据实验室构建红笛鲷cDNA差减文库中的EST片段,设计引物,通过RACE技术得到红笛鲷Integrin-β基因的cDNA全长(GenBank登录号:MG792792,命名为Ls-Integrin-β),该基因全长3 976 bp,开放阅读框(ORF)包含2 409 bp碱基,编码802个氨基酸,理论分子量大小为88.99 kD。氨基酸推导序列分析发现Ls-Integrin-β具有整合素家族保守结构域,C端存在一个跨膜结构域。系统进化树分析红笛鲷与鰤Integrin-β相似度最高。Ls-Integrin-β在健康红笛鲷体内的多种组织均有表达,其中肌肉表达量最高,脑、体肾、皮肤其次,肠道表达量最低。哈氏弧菌刺激后,红笛鲷脾脏中Integrin-β的表达在感染后6 h显著性(p0.05)上调,在12 h达到顶峰。以上结果表明,Integrin-β可能参与了宿主抵御病原入侵的免疫反应,为进一步了解红笛鲷抗菌免疫提供理论基础。     

家蚕C型凝集素S11的克隆、表达及功能研究

【目的】C型凝集素(C-type lectin,CTL)广泛存在于植物和动物中,参与免疫防御反应、发育及细胞信号传导。鳞翅目昆虫中的C型凝集素依据长度和特征功能域可以分成S型、IML型和X型,目前对S型凝集素的功能了解非常有限。本研究对家蚕Bombyx mori L.C型凝集素S11进行了克隆、蛋白表达纯化和初步功能分析。【方法】基于先前对家蚕基因组中所有C型凝集素序列的生物信息学分析,通过PCR克隆了CTL-S11基因的全长c DNA;利用相关软件对核酸和蛋白质序列进行了比对和分析;通过大肠杆菌原核系统表达纯化重组蛋白;通过RT-PCR和荧光定量PCR研究了该基因的组织表达分布和诱导表达;通过凝集实验检测了重组蛋白对细菌的凝集作用。【结果】获得了长度为519 bp的CTL-S11全长c DNA序列,编码173个氨基酸,纯化得到分子量约为18 ku,带有组氨酸标签的重组蛋白。RT-PCR表明该基因在中肠、脂肪体、血细胞和表皮都有表达。荧光定量PCR结果表明,细菌喂食或注射家蚕幼虫后,CTL-S11的表达水平在某些时间点有显著上调。凝集实验显示,在钙离子存在的条件下重组蛋白对大肠杆菌和金黄葡萄球菌有明显的凝集作用。【结论】CTL-S11的表达可以被细菌显著诱导,重组蛋白可以引起细菌的凝集,因此其有可能作为免疫受体参与家蚕对病原微生物的识别。     

亚洲玉米螟C型凝集素CTL6的克隆和功能分析

【目的】鉴定出一种新的亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée) C型凝集素(C-type lectin),并对其功能进行初步研究。【方法】通过生物信息学分析,从亚洲玉米螟转录组中筛选得到一个可能的C型凝集素基因,命名为CTL6。利用RT-PCR技术分析该基因在亚洲玉米螟不同龄期、不同组织及不同病原物诱导下的表达模式。借助原核及杆状病毒真核表达系统产生重组CTL6蛋白,并利用细菌凝集实验对其功能进行初步研究。【结果】CTL6基因cDNA全长序列为1 034 nt,其中完整开放阅读框为945 nt。推导的CTL6多肽序列包括314个氨基酸残基,N端含有由22个氨基酸残基组成的信号肽。CTL6成熟肽中含有两个串联的糖识别结构域,与烟草天蛾Manduca sexta的IML-2 (Immulectin-2)同源性最高。RT-PCR结果显示,CTL6在亚洲玉米螟5龄幼虫期转录水平最高,卵期其次,不同组织中则是在脂肪体中转录水平最高,呈诱导性表达。纯化的CTL6重组蛋白对大肠杆菌Escherichia coli具有一定的凝集作用。【结论】鉴定到的亚洲玉米螟CTL6是一种典型的C型凝集素,重组CTL6蛋白可能参与了亚洲玉米螟对病原菌的凝集作用。     

红笛鲷p38β MAPK基因的克隆及原核表达

鱼类p38 MAPK基因在宿主免疫调控及抵御病原侵染的过程中具有重要作用。利用RACE技术克隆了红笛鲷p38βMAPK基因(Ls-p38β,Gen Bank登录号为KJ502277)。序列分析结果显示,Ls-p38βc DNA全长1 628 bp,开放阅读框1 086 bp,可编码361个氨基酸,预测其编码蛋白的分子量为41.6 k D,理论等电点为5.74。该基因推导的氨基酸序列含有p38 MAPK家族保守的双磷酸化激活环(TGY),与尼罗罗非鱼的p38β有97%的相似性。将此基因定向插入原核表达载体构建重组表达质粒p ET32-p38β后导入BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE与Western blot分析显示约在60 k D出现特异蛋白条带,与预期分子量大小相符,说明Ls-p38β融合蛋白表达成功。     

从细胞色素b基因序列探讨笛鲷属的分子系统发生关系

测定了9种中国南海的笛鲷属鱼类的细胞色素b基因的部分序列,结合来自GenBank中1种分布于菲律宾和9种分布于美国大西洋的笛鲷属鱼类的相应同源序列,用邻接法和最大简约法构建分子系统树。结果显示:红鳍笛鲷(Lutjanuserythropterus)与红笛鲷(L.sanguineus)之间的同源序列碱基差异百分率只有0.32%,支持二者是同种异名的观点;中国南海的笛鲷属鱼类间的平均碱基差异要高于美国大西洋笛鲷属鱼类。在MP和NJ树中,美国大西洋笛鲷表现为亲缘关系较近,来源于中国南海的笛鲷鱼类相对集中在树的基部,分歧较大。这与所研究的笛鲷地理分布和地理隔离基本相一致,同时也说明中国南海笛鲷分化较早并且分歧较大。     

小菜蛾C型凝集素基因PxCTL5的克隆及其在细菌刺激下的转录水平变化

【目的】本研究旨在克隆小菜蛾Plutella xylostella体内一种C型凝集素基因,检测其在小菜蛾体内的表达模式,并探讨该蛋白对细菌的凝集作用。【方法】基于对小菜蛾转录组和基因组进行生物信息学分析的基础上,RT-PCR结合RACE技术克隆小菜蛾C型凝集素基因全长cDNA序列。构建原核表达质粒载体,在大肠杆菌BL21中高效表达小菜蛾C型凝集素融合蛋白,利用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗血清。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小菜蛾C型凝集素基因在小菜蛾不同发育时期(卵期、1-4龄幼虫、预蛹期、蛹期和成虫期)和小菜蛾4龄第1天幼虫不同组织(血细胞、表皮、脂肪体、中肠和马氏管)中的表达模式。RT-qPCR和Western blot检测小菜蛾C型凝集素基因在大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌刺激下的表达差异。显微镜下观察重组蛋白对这两种细菌的体外凝集现象。【结果】克隆了小菜蛾型C型凝集素基因PxCTL5(GenBank登录号:KY807084),cDNA序列全长1 243 bp,开放阅读框(ORF)序列长672bp,编码223个氨基酸残基。RT-qPCR显示PxCTL5基因在小菜蛾各个龄期均有表达,在成虫期处于高水平表达;主要在表皮中表达,可被苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌强烈诱导表达,表达高峰期分别为诱导后18 h和24 h。Western blot检测表明,经苏云金芽孢杆菌和大肠杆菌诱导后,小菜蛾血淋巴中PxCTL5蛋白表达量明显提高。体外凝集实验表明,在钙离子存在下,PxCTL5蛋白对两种细菌都有一定的凝集作用,对苏云金芽孢杆菌的凝集作用较强。【结论】小菜蛾PxCTL5可经细菌诱导表达,PxCTL5对苏云金芽孢杆菌有较强凝集作用。     

大黄鱼Follistatin基因克隆及表达分析

卵泡抑素(follistatin,FST)是转化生长因子β(Transforming growth factor-β)超家族成员之一,在动物肌肉生长中起重要作用。采用RT-PCR、RACE和常规PCR技术克隆了大黄鱼FST基因。获得的基因序列长3195 bp,其中5’非编码区96 bp,3’非编码区47 bp,含5个外显子及4个内含子。该基因开放阅读框972 bp,编码323个氨基酸,其中信号肽31个氨基酸,成熟肽292个氨基酸。Blast结果表明,大黄鱼FST基因与金鲷FST基因的核苷酸及蛋白序列同源性最高,分别达到96%和99%。FST基因在大黄鱼脑、眼、鳃、肾等多个组织中表达,其中鳃组织的表达量最高,脾组织中表达最低。检测水温19℃、25℃、30℃时大黄鱼不同组织FST基因表达量,眼和肌肉组织中FST基因表达量变化显著,推测FST基因可能在鱼类生长发育中发挥重要作用。     

异育银鲫过氧化物还原酶基因的克隆及其表达分析

采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术从异育银鲫Carassius auratus gibelio肝脏中克隆了过氧化物还原酶(Prx)基因的cDNA全长序列。结果显示,异育银鲫过氧化物还原酶(CaPrx)基因cDNA全长1035 bp,开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸。在氨基酸序列的N端和C端各有一个保守的Cys残基,属于2-半胱氨酸类Prxs家族。多序列比对和系统进化树分析表明,异育银鲫与鲫Carassius auratus、青鱼Mylopharyngodon piceus、斑马鱼Danio rerio、犀角金线鲃Sinocyclocheilus rhinocerous和朝鲜鳑鲏Rhodeus uyekii等鱼类的Prx基因具有很高的同源性。实时荧光定量PCR结果显示,CaPrx基因在异育银鲫体内广泛表达,在血细胞和肝脏中表达量最高,在鳃和头肾的表达量较少。在感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的个体中,肝脏和脾脏的CaPrx基因表达量显著下降,表明其抗氧化作用因病毒的感染而受到了一定的破坏。