玉米耐铝毒基因的分离

以抑制消减杂交（SSH）为手段,以玉米对铝敏感的自交系Mo17和耐铝的自交系TL94B为材料,分别构建它们的正向和反向消减文库,分别筛选获得了124、47、103和64个阳性克隆。对文库的鉴定表明,插入片段分布在0.25-1．0kb之间,阳性克隆率在18％左右。对338个阳性克隆进行测序,得到232种表达序列标签（EST）,其中70．2％的EST可推测其功能。结果表明,玉米的铝离子胁迫反应涉及胁迫因子的信号传导、响应基因的转录表达与调控、物质的合成与运输、细胞结构和功能的改变等。     

铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析

柱花草栽培种热研2号(Stylosanthes guianensis ‘Reyan 2’)对铝毒有较强的耐受性。为了鉴定其在铝胁迫下的诱导 基因, 利用抑制消减杂交(SSH)技术构建在300 μmol·L^–1铝胁迫下正向cDNA文库。挑选插入片段大于300 bp的600个克隆进行测序, 共获得504条表达序列标签(EST)。序列重复性分析表明, 其中12.1%的EST只有1次重复, 61.4%的EST有2–16次重复, 重复出现次数较高的EST是细胞色素P450(53次, 占10.5%)、病原诱导型胰蛋白酶抑制剂(44次, 占8.7%)和衰老相关蛋白(37次, 占7.3%)。BLASTX分析显示, 504条EST中有97种非冗余基因, 其中包括46条功能已知基因和51条功能未知序列。46条功能已知EST中有30个为已报道铝胁迫相关基因, 16个是新发现的铝胁迫相关基因。SSH cDNA文库提供的信息为阐明柱花草耐铝毒的分子机制提供了重要线索。     

铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析

柱花草栽培种热研2号（Stylosanthes guianensis‘Reyan2’）对铝毒有较强的耐受性。为了鉴定其在铝胁迫下的诱导基因,利用抑制消减杂交（SSH）技术构建在300μmol·L-1铝胁迫下正向cDNA文库。挑选插入片段大于300bp的600个克隆进行测序,共获得504条表达序列标签（EST）。序列重复性分析表明,其中12.1%的EST只有1次重复,61.4%的EST有2-16次重复,重复出现次数较高的EST是细胞色素P450（53次,占10.5%）、病原诱导型胰蛋白酶抑制剂（44次,占8.7%）和衰老相关蛋白（37次,占7.3%）。BLASTX分析显示,504条EST中有97种非冗余基因,其中包括46条功能已知基因和51条功能未知序列。46条功能已知EST中有30个为已报道铝胁迫相关基因,16个是新发现的铝胁迫相关基因。SSHcDNA文库提供的信息为阐明柱花草耐铝毒的分子机制提供了重要线索。     

干旱胁迫下刚毛柽柳消减文库的构建及分析

以干旱胁迫下的刚毛柽柳根部组织cDNA为tester,正常生长的刚毛柽柳根部组织cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了干旱胁迫下刚毛柽柳根部组织的消减文库。文库克隆的重组率为95%,插入片段大部分集中在250~600 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测序,获得了如Mn-SOD、myb相关蛋白、锌指蛋白等17种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。所得EST序列已被GenBank收录。实验为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下柽柳根部基因的表达奠定了基础。     

干旱胁迫下黄檗幼苗cDNA消减文库的构建和分析

以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。将其进行同源性分析, 划分为16类。获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。     

干旱胁迫下黄檗幼苗cDNA消减文库的构建和分析

以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。将其进行同源性分析, 划分为16类。获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。     

条锈菌诱导的小麦抗病与感病近等基因系SSH文库构建及分析

为分析条锈菌诱导下的小麦抗病与感病近等基因系之间差异表达的基因,以接种小麦条锈菌CY26小种的抗病近等基因系Yr4/6×Taichung 29幼苗叶片cDNA作为实验方,接种CY26的感病亲本Taichung 29幼苗叶片cDNA为驱动方,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个包含1 300余克隆的消减文库。对文库中600个克隆进行了反向Northern点杂交筛选,对获得的阳性克隆进一步进行了Northern杂交验证,获得显著差异的克隆12个。经测序和BlastX分析,其中6个差异表达序列的推测产物分别为亮氨酸重复序列蛋白、过氧化氢酶、硫氧还蛋白、RNA结合蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和热激蛋白。除亮氨酸重复序列为信号传导类蛋白外、其他几个均为抗病防御类蛋白。     

无核荔枝果实形成差异表达基因cDNA的克隆

采用抑制差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)分离与海南无核荔枝果实形成相关的差异表达基因的cDNA片段,为克隆相关基因提供研究基础。分别以无核荔枝的有核幼果为driver;无核幼果为tester,建立差减cDNA文库。经Reverse Northern Dot-Blot筛选该文库,共获得61个阳性克隆,随机选取17个克隆进行测序,共获得10条非重复序列,对其中较长的7个序列进行同源分析,结果表明:有6个序列在荔枝中为首次报道。     

丹波黑大豆GmbHLH30转录因子耐铝功能初步研究

铝毒是酸性土壤作物生长的主要限制因素。前期研究发现,铝胁迫下,耐铝型丹波黑大豆SSH(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库中bHLH30转录因子基因上调表达,推测该基因与丹波黑大豆耐铝性相关。克隆GmbHLH30基因,构建GmbHLH30植物表达载体pK2-35S-GmbHLH30,并在烟草中过量表达获得转GmbHLH30的转基因烟草植株。在铝胁迫下,转GmbHLH30的转基因烟草相对根伸长率比野生型烟草大,可溶性糖和脯氨酸含量高,H2O2水平低。表明GmbHLH30基因的过量表达可以增强植物的耐铝能力,暗示GmbHLH30转录因子参与调控植物的耐铝特性。     

激活蛋白处理水稻引发基因差异表达的研究

利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)成功构建了植物激活蛋白处理水稻与非处理组水稻中差异表达的消减cDNA文库。从文库中一共筛选到1756个克隆,通过反向Northern杂交,从中得到264个有效克隆并测序,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对分析,获得28个上升表达差异基因。通过分析这些基因与植物的光合作用、营养物质的运输代谢等多种植物的生理生化功能相关。本研究为揭示激活蛋白的作用机理奠定基础。