基于微卫星标记的圆口铜鱼亲子鉴定技术

为快速有效地鉴别不同的圆口铜鱼家系及来源, 研究从已发表的40个微卫星标记中筛选出20个多态性较高且稳定扩增的微卫星位点, 通过对8个圆口铜鱼家系339尾个体进行微卫星基因分型检测, 建立了圆口铜鱼荧光微卫星标记与多重毛细管电泳相结合的亲子鉴定技术。遗传多样性分析结果显示, 圆口铜鱼8个家系群体的平均等位基因数(N_a)为9个, 平均多态信息含量(PIC)为0.616, 平均期望杂合度(H_e)为0.659, 平均观测杂合度(H_o)为0.691, 其中子一代群体的遗传多样性水平明显低于亲本群体。亲子鉴定分析结果显示, 当双亲基因型未知时其单亲累积排除概率(CE-1P)为0.99954473, 当单亲基因型已知时其累积排除概率(CE-2P)为0.99999825, 当双亲基因型未知时其双亲累积排除概率(CE-PP)为1.00000000, 当使用20个微卫星位点进行亲子鉴定时, 297尾子一代均能正确找到其父母本, 亲子鉴定准确率为100%。由此可见, 研究建立的圆口铜鱼亲子鉴定技术是可靠的, 能为圆口铜鱼的家系管理、种群遗传管理和增殖放流效果评估提供科学依据     

不同生境草鱼肠道微生物组成和群落特征分析

[目的]分析不同生境来源的草鱼前肠、中肠和后肠的微生物组成和群落特征.[方法]利用16S rRNA高通量测序技术比较河流、湖泊、高密度池塘养殖与水库低密度养殖4种不同生境来源的草鱼其前、中、后肠的微生物组成和群落特征.[结果]Venn图、稀释性曲线和Alpha指数分析结果显示,前肠微生物群落多样性以养殖生境草鱼更高,而...     

鳙基于10个微卫星标记的亲子鉴定分析

为开展鳙(Hypophthalmichthys nobilis)家系选育工作,本研究进行了基于微卫星标记的亲子鉴定研究。试验中筛选了10个扩增效率较高的微卫星标记,通过引物荧光修饰,引物结合毛细管电泳分型技术,对鳙48尾亲本及384尾子代进行了基因分型,并计算了等位基因频率和模拟分析和亲子鉴定等分析。结果发现,各位点的等位基因数介于4~13之间,其中9个位点均具有较高的多态性和杂合度(PIC>0.5,He>0.5),研究发现位点的多态性信息含量(PIC)与亲本对排除率(E-PP)存在显著正相关(p<0.01)。模拟分析结果显示,该10个标记预计可用于已知性别的50组亲本(100尾)或未知性别的50尾亲本的鉴定分析(鉴别成功率>95%)。亲子鉴定发现,对试验中2个交配组(每组12对亲本)的鉴别成功率分别为98.96%和100%;且父母本对子代的贡献率存在极显著差异(p<0.01)。通过累积位点的鉴定分析发现,当标记数为7个和9个时分别能满足试验中12组和24组亲本对应子代的鉴定分析(鉴别率>95%),模拟分析和亲子鉴定分析成功率趋势基本符合。本研究所开发的亲子鉴定技术可为鳙家系选育提供技术支持。     

一种基于高密度遗传标记的亲子鉴定方法及其应用

系谱是人类遗传及动植物育种研究与实践的重要信息来源之一。系谱记录错误是育种生产中普遍存在的一种记录错误,影响基因定位、遗传值及表型值预测等相关研究结果的可靠性。现有的方法软件可以利用遗传标记信息对疑似亲子进行亲子鉴定,但这些软件方法操作复杂,限制标记数量,如Cervus。针对当前高密度SNP标记在人类及动植物研究中广泛应用的现状,文章提出了一种基于全基因组高密度SNP数据的亲子鉴定新方法,命名为EasyPC。对EasyPC及Cervus的运行效率进行了对比,并用中国荷斯坦牛(n=2180)和杜洛克猪(n=191)的全基因组SNP芯片数据对EasyPC进行了验证。结果表明：EasyPC运行效率高于Cervus,牛和猪群体系谱错误率分别为20%和6%,与相关研究报道相符。通过使用全基因组SNP标记对群体孟德尔错误率的经验分布进行分析,该方法不仅可以简单、快速、准确地判别系谱的正确性,而且还可以对错误系谱进行校正。EasyPC为解决全基因组研究中基因型及系谱数据前处理过程中的系谱校正问题提供了一种新的途径。     

感染GCRV的草鱼miRNA测序与比较分析

为探索基于高通量筛选抗性主效miRNA功能分子的方法应用于抗性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的选育,研究借助高通量测序鉴定分析感染GCRV前后的草鱼头肾组织中miRNAs.测序结果共鉴定出821个成熟miRNAs,其中118个在GCRV攻毒组特异表达,82个为未攻毒组特有;差异分析结果显示,G...     

关于草鱼肠炎微生态调节的研究

对健康草鱼肠道菌、患肺炎病草鱼肠道菌进行菌群分析,发现正常草鱼肠道中有气单胞菌(Aeromonas)、哈夫尼亚菌(Hafnia)、黄杆菌属(Flavobacterium)等多种菌,肠炎病鱼肠道中一般仅有气单胞菌的单一菌群。拮抗试验表明哈夫尼亚菌与气单胞菌之间有一定的拮抗性。回归试验表明哈夫尼亚菌无致病性,3种气单胞菌有致病性。微生态治疗试验表明哈夫尼亚菌对患肠炎病的草鱼肠道有促进肠道微生态平衡作用。     

感染草鱼呼肠孤病毒对肠道菌群多样性的影响

为揭示草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道菌群的影响, 在通过人工浸泡方式感染GCRV后, 采用针对16S rRNA基因的高通量测序技术对草鱼肠道菌群的组成和多样性进行了研究。结果显示, 感染组与对照组差异显著(MRPP, Anosim, Adonis, P<0.01), 且感染组肠道菌群的Alpha多样性指数(Shannon-Wienner、Inverse Simpson、Pielou evenness)显著低于对照组(t-test, P<0.05)。此外, 肠道菌群在感染组个体间差异显著大于对照组(Wilcoxon test,P<0.05), 表明患病草鱼肠道菌群失去原有平衡而变得紊乱。尽管病毒感染组和对照组草鱼肠道优势菌门均为Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Fusobacteria, 但在OTU水平仍表现出明显的变化, 如OTU_69(Pasteurellaceae)、OTU_504(Comamonadaceae)和OTU_1898(Cetobacterium)在感染GCRV组丰度显著降低(t-test, P<0.05), 也表明GCRV感染可使草鱼肠道微生态发生紊乱。肠道菌群结构稳定对于宿主健康具有重要意义, 研究患病鱼肠道菌群状况为鱼类常见疾病的防控提供科学依据, 也为健康养殖提供参考。     

微卫星标记对牙鲆有丝分裂雌核发育家系的亲子鉴定

利用18个微卫星标记,对6个家系的26尾有丝分裂雌核发育牙鲆进行亲子鉴定,PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明:1个座位在母本中表现为相同的基因型,视为单态座位,其他17个座位为多态;多态座位在亲子鉴定中的累计排除概率和累计个体识别概率分别为0.9985、0.9999;根据被测个体在17个微卫星座位的基因型,最后确认26尾子代的母本,其中7尾子代在某些座位表现出与其母本不完全匹配的基因型。利用微卫星标记可确定雌核发育后代的亲子关系,从而构建牙鲆雌核发育家系系谱,对牙鲆雌核发育的深入研究具有重要意义。     

基于转录组数据的杜仲红叶性状SSR分子标记分析

对‘华仲12号’杜仲的幼嫩叶片（绿色）和成熟叶片（红色）及‘华仲11号’杜仲成熟叶片（绿色）进行转录组测序,进行测序数据的拼接和组装,且对转录组获得的基因（Unigenes）进行SSR分析。研究得到54 517条平均长度为806.90 bp的Unigenes,其中25 993条Unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG蛋白数据库获得功能注释,占所有Unigenes的47.68%。参照KEGG数据库,可将注释到的6 910条Unigenes划分到122个代谢途径分支,其中花色苷代谢途径相关酶基因39个,类黄酮代谢途径38个,类胡萝卜素合成途径34个。54 517条Unigenes中共包含17 010个完整型SSR位点,占总SSR位点的96.28%。完整型SSR位点共包含67种重复基元,其中出现频率最高的重复基元类型为单核苷酸重复中的A/T （7 747个）,其次是AG/CT （5 039个）和AT/AT （850个）从花色苷代谢途径、类黄酮代谢途径及类胡萝卜素代谢途径中共找到13个SSR位点。为今后杜仲遗传多样性分析、遗传图谱构建及杜仲红叶性状分子标记开发等方面奠定了分子基础。     

基于DNA分子标记的花粉流动态分析

花粉介导的基因流是植物有性繁殖世代之间的桥梁, 花粉散布属性是植物繁殖生态学、保护生物学和进化生物学研究关注的焦点。随着DNA分子技术的发展, 花粉流分析所使用的分子标记(尤其是微卫星标记)逐步替代了早期物理标记, 基于最大似然法估计以及新兴的基于贝叶斯推断的父本指派算法的发展, 能有效地估计花粉流散布的方向、距离和强度等重要特征。花粉散布曲线由单一参数向多参数模型发展, 以更好地获得花粉散布特征的拟合效果, 双组分的复合模型利用相互独立的参数空间使得散布曲线在长距离和短距离形状上呈现更大的可塑性。这些革新的技术和方法被成功应用于植物性别表型、隔离种群和杂交物种间花粉流分析, 以探讨进化、生态和保护等多领域的基础理论问题。近年来, 高通量测序技术的发展将进一步加快以分子标记为基础的花粉流动态分析在更广泛的植物类群中运用。     

草鱼肠道黏膜厌氧细菌的分离与鉴定

研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象, 运用厌氧培养的方法, 研究了饥饿状态下草鱼肠道黏膜固有微生物的类群及其在不同肠段的分布。实验结果显示草鱼前肠、中肠与后肠中细菌的数量分别是3.17×103、1.63×104和1.79×107 cfu/g。研究共分离到274株单菌落, 经16S rRNA鉴定, 分别属于拟杆菌属(Bacteroides spp.)、鲸杆菌属(Cetobacterium spp.)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、希瓦氏菌属(Shewanella spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、泛菌属(Pantoea spp.)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)8个种类, 其中专性厌氧细菌的数量占9.1%, 兼性厌氧细菌的数量占90.9%。进一步分析发现, 前肠中只分离到兼性厌氧细菌, 中肠与后肠专性厌氧细菌和兼性厌氧细菌都有分布。专性厌氧细菌Bacteroides paurosaccharolyticus和Bacteroides luti在中肠与后肠都有分布, 而Cetobacterium somerae和Fusobacterium ulcerans只在后肠有发现。兼性厌氧细菌是草鱼肠道黏膜的优势菌群, 其中嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila占73.7%。草鱼肠道不同部位固有厌氧微生物组成存在差异, 细菌数量也明显不同, 后肠中具有更高的细菌丰度和多样性。     

睡美人转座子在草鱼CIK细胞中介导的高效基因整合

为研究睡美人(Sleeping Beauty, SB)转座子系统在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾脏细胞(CIK)中介导的整合特性, 构建了SB转座子和转座酶在两个质粒的二元反式(trans)转座子系统, 以及转座子和转座酶元件在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子系统; 通过转染CIK细胞, 用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR分析了转染2d后及嘌呤霉素筛选4周后的细胞, 测定DsRed转染效率和整合效率, 并结合高效热不对称交互式PCR扩增获得SB转座子整合位点的序列。结果表明, SB二元转座子系统的整合效率远高于一元系统; SB转座子与转座酶比例为1﹕2时, 外源基因DsRed的整合效率最高; SB转座子偏向于插入草鱼基因组TA序列处。研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在草鱼细胞中的整合效率并快速获得突变细胞, 同时为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础。     

饲料中发酵芝麻粕替代菜粕对草鱼生长性能、肠道形态和微生物及小肽转运相关基因表达的影响

实验以初重(99.98±0.69) g的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为研究对象, 研究饲料中发酵芝麻粕替代菜粕蛋白对草鱼生长性能、肠道形态和微生物以及小肽转运相关基因表达的影响。添加0、5%、10%和15%发酵芝麻粕分别替代菜粕蛋白0、11.8%、23.5%和35.1%, 配制4组等氮等脂的饲料, 分别为对照组、实验1组、实验2组和实验3组。实验在室内循环水养殖系统中进行, 每组3个重复, 每一重复饲喂20尾鱼, 每天饱食投喂2次, 实验共持续45d。结果发现: 各处理组间草鱼增重率、特定生长率和蛋白质效率均无显著差异, 实验1组和2组略高于对照组(P>0.05); 组间饵料系数也无显著差异, 实验1组和2组略低于对照组(P>0.05)。实验组草鱼肠绒毛高度均显著高于对照组(P<0.05), 而实验组隐窝深度小于对照组 (P>0.05), 绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C)在实验组也显著高于对照组(P<0.05)。随着发酵芝麻粕替代比例的增加, 乳酸杆菌(Lactobacillus)和芽孢杆菌(Bacillus)占比显著上升(P<0.05), 而大肠杆菌(Escherichia coli)和气单胞菌(Aeromonas)占比显著下降。小肽转运相关基因方面, 尾型同源盒基因2 (CDX2)、特异性蛋白1 (Sp1)和小肽转运蛋白1 (PepT1)基因mRNA相对表达量均随着发酵芝麻粕替代比例的增加呈现先显著上调后下调的趋势, 且均在实验1组时达到最大值(P<0.05)。综合考量鱼体生长性能、肠道黏膜形态、菌群及小肽转运相关基因表达方面, 草鱼饲料中发酵芝麻粕蛋白适宜替代菜粕蛋白的比例为11.8%—23.5%。     

水飞蓟素抑制草鱼肝细胞脂质蓄积的作用及其机制研究

为探究水飞蓟素(Silymarin)对草鱼肝细胞脂质蓄积的作用及其机理, 体外培养草鱼肝细胞, 在用400 μmol/L油酸对其进行蓄脂诱导的同时, 采用不同质量浓度的水飞蓟素处理24h, 检测了肝细胞活力、脂质蓄积状况、抗氧化指标和脂质代谢相关基因表达状况。结果显示, 水飞蓟素质量浓度在75—125 μg/mL对草鱼肝细胞活力无影响(P>0.05); 与单独采用油酸进行蓄脂诱导的油酸组比较, 水飞蓟素和油酸共同处理的水飞蓟素组中, 随着水飞蓟素质量浓度的增加, 肝细胞内的脂质含量逐渐降低, 且水飞蓟素质量浓度在100—150 μg/mL时的肝细胞脂质蓄积水平显著降低(P<0.05); 与油酸组相比, 100 μg/mL水飞蓟素处理组的脂质含量以时间依赖性的模式显著降低(P<0.05), 还原型谷胱甘肽含量显著升高(P<0.05), 脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶1的mRNA表达量显著下调(P<0.05)。研究表明, 水飞蓟素能够抑制草鱼肝细胞脂质蓄积, 其作用可能与其抑制脂质合成基因的表达有关; 同时, 水飞蓟素可能通过提高肝细胞的抗氧化能力发挥保护肝细胞的作用。     

饲喂不同浓度黄曲霉毒素B1饲料对草鱼幼鱼生长和毒素积累的影响

以含不同浓度黄曲霉毒素B₁(AFB₁)(0、10、20、100、1000和5000 μg/kg饲料)的6种等氮等能(32.96%蛋白质, 14.55 kJ/g能量)配合饲料饲喂平均初始体质量为(2.90±0.16) g草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼84d, 探讨AFB₁对草鱼幼鱼生长、肝胰脏和肾脏组织结构以及鱼体肌肉中的毒素积累的影响。实验分为6个实验组, 每组3个平行。结果表明, 在整个实验过程中各实验组幼鱼的行为均未表现出异常, 各组幼鱼的存活率、终末体重、摄食率、特定生长率、饲料效率、肝体比、脏体比均无显著差异。饲料AFB₁水平对草鱼幼鱼血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均无显著影响。各毒素组和对照组肝胰脏、肾脏组织学观察中未发现病理变化。摄食AFB₁≤1000 μg/kg的草鱼幼鱼肌肉中未检测出AFB₁残留, 仅在5000 μg/kg实验组中检测出肌肉中含有(1.21±0.18) μg/kg的AFB₁, 低于FDA食品安全限定标准。由此可见, 草鱼幼鱼至少可耐受AFB₁含量达5000 μg/kg饲料(实测值: 4979.2 μg/kg饲料) 84d。     

草鱼树突状细胞的分离鉴定及益生芽孢杆菌对其免疫功能的影响

为揭示草鱼(Ctenopharyngodon idellus)树突状细胞(Dendritic cells)的生物学特性及益生芽孢杆菌对其免疫功能的影响,研究通过草鱼体外细胞培养技术分离获得草鱼DCs,对其形态学特征、生物学功能及膜表面标记分子的表达进行了分析鉴定; RT-PCR检测了益生芽孢杆菌对草鱼DCs免疫相关细胞因子表达的影响。结果表明草鱼DCs具有典型的树突状形态,可有效地激活T淋巴细胞的增殖并具有迁移能力。LPS刺激可促进其成熟过程,显著提升膜表面标记分子CD80/86、CD83的表达。这表明草鱼DCs和哺乳动物DCs在形态和功能上具有高度相似性。RT-PCR结果显示,在体外条件下使用紫外照射灭活的益生枯草芽孢杆菌对草鱼DCs进行刺激后,抗炎性因子IL-4, IL-10的表达水平显著提升(P<0.05),并在12h时达到峰值。这表明枯草芽孢杆菌可通过促进树突状细胞分泌抗炎性因子来影响其免疫功能。以上结果为进一步研究鱼类树突状细胞的生物学特性及益生芽孢杆菌对其免疫功能的影响提供了重要的依据。     

草鱼IL-10单克隆抗体的制备与鉴定

白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)参与机体免疫应答调节, 协同其他细胞因子维持免疫系统稳态。为探究草鱼(Ctenopharyngodon idella)IL-10的细胞来源, 研究利用大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)表达系统制备了高纯度的草鱼IL-10重组蛋白, 免疫小鼠制备单克隆抗体后通过免疫印迹、激光共聚焦和流式细胞术对抗体进行分析。结果表明, 获得的单克隆抗体不仅能特异识别大肠杆菌表达的CiIL-10重组蛋白, 而且能识别HEK293细胞中表达的真核IL-10重组蛋白。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和草鱼白细胞介素1β(IL-1β)刺激草鱼性腺细胞系(GCO)36h的免疫荧光染色分析表明, 草鱼IL-10单克隆抗体能与草鱼内源IL-10结合, 但IL-10阳性细胞数量在LPS处理前后无明显变化。该研究成功制备了高纯度CiIL-10重组蛋白, 获得了特异性好的高质量单克隆抗体, 为研究草鱼ILC2和Th2细胞的增殖、分化和功能奠定了基础。     

草鱼在摄食高能饲料后血清生化指标的动态变化

为研究草鱼(Ctenopharyngodon idella) 在摄食高能饲料后血清生化指标的动态变化, 选择均重为(55.0±2.5) g 的健康草鱼320 尾, 随机分成4 组, 每组4个重复, 分别以3组高能纯化饲料(分别以额外的蛋白质、脂肪、糊精供能, 高能饲料组较对照组总能量提高11%)及对照组饲料喂养草鱼11周后, 将鱼体禁食48h后采样(对照), 再饱食投喂, 在摄食后的2h、8h和24h取样, 测定实验鱼8种血清生化指标, 并对采样时间点(T)和不同饲料(D)进行双因素方差分析。为确保实验结果的准确性, 需要保证不同处理组的采样时间同步性, 即均在餐后同一时间点采样。结果显示: 除血清总胆固醇(TCHO)含量外, 血清碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性, 以及血清甘油三酯(TAG)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)含量均受到采样时间点(T)即餐后时间的显著影响, 饲料(D)对上述8个指标亦均有显著影响, 且两者存在交互作用。草鱼血清GLU含量和血清AST活性均在餐后2h达到峰值, 血清ALT和ALP活性以及LDLC含量均在餐后24h达到峰值, 血清TAG含量在餐后8h达到峰值, 而血清TCHO和HDLC含量则无明显峰值。在餐后24h, 3个高能组的ALT活性和GLU含量较对照组显著升高, 血清AST和ALP活性以及TAG、TCHO和HDLC含量较对照组无显著差异。上述结果表明, 草鱼血清生化指标受到餐后采样时间点和饲料的显著影响。     

饲料蛋白质和小麦淀粉水平对中大规格草鱼生长性能及肝脏组织结构的影响

草鱼(Ctenopharyngodon idella)对碳水化合物的利用能力显著优于脂肪, 因此研究碳水化合物与蛋白的相互作用关系是解决草鱼配方策略的重要途径。实验探讨了中规格(460 g)草鱼和大规格(1970 g)草鱼饲料中蛋白与碳水化合物的相互作用关系。实验采用2×4的双因子实验设计, 实验一: 中规格草鱼饲料的2个淀粉梯度为25%和35%, 4个蛋白梯度为22%、24%、26%和28%, 共8个处理; 实验二: 大规格草鱼饲料的2个淀粉梯度为30%和40%, 4个蛋白梯度为18%、20%、22%和24%, 共8个处理。在56d的等量投喂后, 实验结果显示: 中规格草鱼的生长性能随着饲料蛋白水平的升高显著上升, 在28%蛋白水平组达到最高(P<0.05), 且小麦淀粉水平35%组的生长性能显著高于25%组(P<0.05); 大规格草鱼的生长性能也随着饲料蛋白水平的升高显著上升, 在蛋白水平大于20%之后差异不显著(P>0.05), 且小麦淀粉水平40%组的生长性能显著高于30%组(P<0.05)。同时, 中规格和大规格草鱼饲料分别添加35%和40%小麦淀粉时不会对草鱼的肝脏组织造成明显的负面影响。由此可见, 在实验条件下, 中规格和大规格草鱼分别在饲料小麦淀粉水平35%和40%以内时, 可以有效地利用淀粉节约饲料蛋白而不造成肝脏组织损伤。