巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）微管相关蛋白全长cDNA克隆及表达分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中分离到微管相关蛋白（Microtubule-associated protein,MAPs）基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification ofcDNA Ends）进行差异片段的5＇和3＇端的扩增,获得了长度为788bp的全长cDNA,该基因在GenBank中的登录号为AY461412.序列分析表明该基因包含完整的开放阅读框,编码144个氨基酸,与微管相关蛋白基因家族具有很高的同源性,推测该基因是微管相关蛋白基因.半定量RT-PCR检测证实它在胶乳中的表达强于叶中,胁迫处理（伤害及乙烯处理）使其表达上调.     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

鼻咽癌相关基因NAP1的克隆及鉴定

从UniGene库中选取编号为BG231197,来自人鼻咽组织的EST序列.利用Blast检索GenBank的nr数据库和EST数据库,构建EST重叠群.利用人类基因组草图搜索法从成人正常鼻咽组织中PCR扩增获得该基因全长cDNA,命名为NAP1,GenBank登录号为AY190326.NAP1基因cDNA序列全长为573 bp,编码由85个氨基酸组成,相对分子质量为9 700的多肽.用α-³²P-dCTP标记NAP1基因片段,与含15种正常成人组织的多组织RNA印迹膜杂交,结果表明NAP1基因在淋巴结和气管中高表达,转录本大小约为0.6 kb,在其他组织中不表达.NAP1蛋白质与滤泡树突状细胞（follicular dendritic cell, FDC）的一种分泌肽前体（FDC -SP）（AF435080）同源,与其他已知蛋白质无明显同源性.NAP1基因定位在染色体4q13,基因组跨越9 179 bp,含5个外显子和4个内含子.采用差异RT-PCR检测了40例经病理诊断为低分化鳞状上皮癌的鼻咽活检组织及其对侧相应部位的正常鼻咽组织中该基因的表达差异.在40例鼻咽癌中,NAP1基因表达下调的有17例（42.5%）,表达上调的有6例（15%）,无明显表达差异的有17例（42.5%）.原位杂交和免疫组化结果显示该基因在正常鼻咽和鼻咽癌组织间质中的树突状细胞中表达,在其他间质细胞和鼻咽上皮中均不表达.以上结果表明,NAP1为树突状细胞的一种新的多肽,该基因在鼻咽癌组织中表达下调的原因,及其与鼻咽癌发生、发展的关系值得进一步探讨.     

新基因人MOB cDNA的克隆与功能分析

人MOB基因被认为是在脑组织中高表达的5次跨膜而功能未知的膜蛋白.从胎儿和成人肾脏消减杂交cDNA文库中获得了一条新的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）序列,该序列对应于功能未知的MOB基因.利用生物信息学分析工具和分子生物学技术,从胎儿肝脏中成功地克隆了人MOB基因cDNA序列,同时也获得了含有完整开放读码框的大鼠和鸡MOB的电子全长序列.人MOB基因定位于10q11.1～11.2之间,含有一个1 242 bp的开放阅读框,第415位开始的ATG可能是翻译起始位点.核酸序列相似性搜索发现,其他种属中存在与之高度相似的EST序列,如爪蟾（79%）、羊（87%）、猪（94%）、牛（93%）.蛋白质序列相似性搜索发现,人MOB与大鼠、小鼠和鸡MOB有97%、97%、91％的相似性,与其他一些不同种属来源的假想蛋白有45%～73%的相似性.不同物种之间MOB基因核酸和蛋白质序列的高度相似说明,MOB是进化上高度保守的蛋白质.保守结构域分析发现,人、小鼠、大鼠和鸡MOB结构域组成完全一致,N端均与不育α基序（sterile alpha motif,SAM）结构域显著匹配,随后出现匹配显著性稍差的几个结构域.核酸和蛋白质序列的保守性提示,除N端约70个氨基酸组成SAM结构域外,其余的保守氨基酸可能形成一个新的保守的MOB结构域.表达谱分析表明,人MOB基因在所有被检组织和细胞中都表达.亚细胞定位研究显示,人MOB广泛表达于细胞内,主要在细胞核.DNA含量测定结果表明,人MOB基因过表达并不影响HeLa细胞的细胞周期和凋亡.总之,人MOB蛋白是一个在多种组织和细胞中广泛表达、细胞内广泛分布、进化上十分保守的蛋白质,可能通过特定蛋白质之间的相互作用,参与多种发育过程的调节.其过表达不影响HeLa细胞的周期和凋亡.     

猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC2）基因出发,在dbEST数据库中进行同源性搜索,找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证,获得猪TNNC2基因全长cDNA序列,其全长843bp,开放阅读框为201～683bp,编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明,与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93.6％、90.5％,蛋白序列同源性均为97.5%。多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在骨骼肌中表达,并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。     

多发性骨髓瘤细胞中一个表达上调基因的克隆与分析

根据GenBank收录的多发性骨髓瘤细胞株 (ARH 77)表达上调ESTAF4 2 5 30 0设计引物 ,运用RT PCR检测了 5例多发性骨髓瘤患者及 4例正常人骨髓细胞中该EST的表达水平 .Northern印迹杂交分析该EST在多种组织中的表达 .进一步利用该EST作探针 ,筛选ARH 77cDNA文库 ,获得全长cDNA克隆 ,对该序列进行了分析 .结果显示 ,该EST在多发性骨髓瘤患者骨髓细胞中亦有较高的表达 ,而在正常人骨髓细胞中低表达 .经测序证实 ,该cDNA全长为 4 5 2bp(GenBank收录号 :AF4 87338) .预测其编码一个 5 7个氨基酸的小分子量蛋白质 ,属于与DNA复制有关的解旋酶 引物酶基因家族的新成员 .该基因在多发性骨髓瘤细胞中表达上调 ,其表达水平的改变可能与多发性骨髓瘤的发生与发展有关     

筛选代表小鼠植入前胚胎紧密化相关基因的EST

分别收集181及241枚昆明白小鼠8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎,采用SMART PCR方法直接合成胚胎双链cDNA.进而运用抑制消减杂交技术(SSH)对8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎的基因表达进行研究,并将所获得的差异表达产物按片段大小分段分离纯化后克隆入pUCm-T载体中,经PCR鉴定后挑选阳性克隆进行测序,筛选出27个代表8细胞早期胚胎和紧密化8细胞胚胎差别表达基因的cDNA片段;经与GenBank中收录的序列进行同源性匹配分析,证实其中17个eDNA片段为新的EST,提交GenBank后被接受并给予了新序列编号.这1 7个片段均可能为与紧密化密切相关的新基因的表达片段,为今后进一步克隆新的紧密化相关基因的全长cDNA及后续新基因的结构和功能研究打下基础.通过采用不同长度大小片段分别克隆的方法,可获得较长片段的EST,避免差异表达大片段的丢失.     

野生罂粟COR基因克隆及转化

以野生罂粟幼叶总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到可待因酮还原酶基因COR的cDNA序列,所获得的cDNA序列全长966 bp,具有完整的ORF,编码321个氨基酸.Blast分析表明,该片段与GenBank中的可待因酮还原酶基因(COR)家族相似性很高,其中与基因COR1.1的一致性最高可达98.96%,该片段命名为COR(GenBank,登录号为FJ624147).以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含可待因酮还原酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARC,转化烟草获得转基因植株.     

草地螟羧肽酶A基因的克隆、表达及序列分析

羧肽酶是昆虫体内重要的消化酶系之一。利用甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）围食膜多克隆抗体免疫筛选草地螟Loxostege sticticalis L.中肠cDNA表达文库, 得到编码羧肽酶A的全长cDNA克隆。该cDNA克隆全长1 380 bp （GenBank登录号EU924506）, 开放阅读框长1 302 bp, 编码434个氨基酸, 预测分子量和等电点分别为49.1 kDa和9.56。序列含有胰蛋白酶切割位点和催化特征, 具有典型的羧肽酶A特性。将该基因与pET30载体重组后, 经IPTG诱导, 蛋白在大肠杆菌中获得了表达。     

Structure and Growth-Dependent Regulation of the Human Cyclin B1 Promoter

As a step toward defining the signals important for the regulation of cyclin B1 expression, we cloned, sequenced, and partially characterized a 1012-bp genomic fragment encompassing the human cyclin B1 promoter. By transient expression experiments, we found that promoter activity resides within a -150/+182-bp DNA fragment. The activity of this promoter fragment was high in asynchronous NIH-3T3 cells, but dramatically decreased in quiescent cells. Time-course experiments, using stable transfectants expressing the CAT gene under the control of this fragment, were performed after releasing the cells from serum starvation. The results showed that the promoter becomes active at the end of the S phase and its activity increases during the cell cycle. Similar experiments performed with a shorter promoter region (-58/+182) showed that this 5′ deletion mutant is active throughout the cell cycle. In good agreement with promoter activity, Northern analysis indicated that the endogenous gene is negatively regulated in quiescent murine NIH-3T3 cells. The data presented here demonstrate that in NIH-3T3 cells the cyclin B1 promoter is growth regulated, and important regulatory elements must exist in the region spanning - 150 to 58 bp.     

Analysis of mRNA for class I HLA on human gametogenic cells

We have studied mRNA expression for Class I HLA (human leukocyte antigen) on male germ cells by amplification of gene fragments in PCR techique and by Northern hybridization. RNA was extracted from fractionated gametogenic cells (isolated from testis) and reversely transcribed. Then, cDNA was amplified for specific HLA sequence (1151 bp) representing whole-length coding sequence (HLA, -A, -B, -C). The specificity of this product was confirmed in “nested” PCR of 400 bp gene fragment coding for alpha 2 domain, alpha 3 domain, and the transmembrane portion of Class I HLA. The results indicate minimal expression of classical Class I HLA on gametogenic cells. Northern hybridization with 669 bp cDNA fragment (spanning for alpha 3 domain, transmembrane, cytoplasmic, and 3′ untraslated region) resulted in a low intensity signal from gametogenic cell fractions and confirmed our findings obtained by PCR. The minimal expression of classical HLA antigens may create a neutral cover for the male reproductive system, thereby preventing an immunological response during germ cell differentiation. © 1994 Wiley-Liss, Inc.     

Variations in c-fos mRNA expression during serum induction and the synchronous cell cycle

Induction of c-fos mRNA levels associated with the stimulation of growth by fetal bovine serum following quiescence was examined in three cell types following brief (24 h) serum starvation. Starved NIH-3T3 and HeLa S3 cells experienced c-fos mRNA induction 20-30 min after addition of serum. In contrast, Swiss-3T3 cells expressed c-fos constitutively following serum starvation. The pattern of oncogene expression coincided with the level of quiescence of each cell line prior to induction. Serum inductions of c-fos expression was dependent upon the response of each cell line to serum starvation, c-fos expression was also examined in HeLa S3 cells that had been separated into sequential cell cycle phases by centrifugal elutriation, c-fos expression peaked during the earliest part of the synchronous G1 phase. The amount of c-fos mRNA measured was approximately twice that found during other cell cycle phases. This suggests that, in addition to its role during the transition from quiescence, the c-fos gene product may play a regulatory role during the earliest part of G1 phase of the continuous cell cycle.     

大鼠神经元凋亡相关碱性蛋白ARBP cDNA的克隆和功能

利用cDNA末端快速扩增 (RACE)方法 ,得到凋亡相关碱性蛋白 (ARBP)的全长序列 ,进而构建了其真核表达体系以了解其功能 .ARBP的全长cDNA序列为 90 1bp ,其开放读码框架编码 10 9个氨基酸残基 .免疫组化分析表明 ,ARBP蛋白在大鼠体内有广泛的分布 .在R2L1细胞中转染ARBP反义cDNA表达载体后 ,既可以促进细胞增殖 ,又可以抑制去血清诱导的细胞凋亡 .因而 ,ARBP蛋白对神经元细胞的凋亡具有重要的调节作用 .     

利用噬菌体抗体库筛选U251细胞血清应答基因蛋白特异抗体

利用噬菌体表面展示抗体库对不同血清处理U251细胞吸附的抗体进行差异筛选,筛选获得血清饥饿细胞吸附的阳性噬菌体克隆96个和血清饥饿后恢复血清培养细胞吸附的阳性噬菌体克隆82个。细胞免疫组化检测发现应答反应差异较大的抗体2个,即血清饥饿培养细胞特异反应的抗体1个（11号抗体）和血清饥饿后恢复血清培养细胞特异反应的抗体1个（2号抗体）,其中2号抗体在恢复血清培养细胞中的应答反应强于血清饥饿培养细胞,是一个血清应答基因蛋白特异抗体,且在血清饥饿后恢复血清培养不同时间的U251细胞中具有一定的特异性反应。该研究为寻找与细胞周期调控有关的因子奠定了基础,同时对肿瘤的诊断和治疗研究也有重要意义。     

可溶性CD14基因克隆及序列分析

针对人可溶性CD14(sCD14）的cDNA序列设计引物,通过反转录PCR技术,从U937细胞中,扩增出编码人可溶性CD14的基因序列,并将其克隆至质粒pGEM－T中,通过PCR、酶切及序列测定鉴定重组载体。结果表明获得了人可溶性CD14基因片段,为下一步进行CD14表达及生物学活性研究奠定了基础。     

新型小鼠淋巴组织特异性肌动蛋白结合蛋白相关序列cDNA克隆

 应用抑制性差减杂交技术 ( SSH)克隆两种不同小鼠胸腺基质细胞的差异表达基因 ,获得新基因片段 C55.通过 Gen Bank检索及 RT- PCR扩增出一个全长 1 .4kb的 c DNA.杂交分析认为它是一个完整的 c DNA序列 .c DNA序列分析表明 ,它拥有一个 636bp的开放读码框架 ,编码 2 1 2个氨基酸 .同源序列比较发现 ,它编码一个肌动蛋白相关蛋白的新成员 ,该序列与多种已知的肌动蛋白相关蛋白 SM2 2 α及其同源蛋白在氨基酸水平上有 62 %～ 95%的同源性 .Northern杂交分析显示 ,该基因 m RNA转录本在两种不同胸腺基质细胞中的表达存在显著差异 . RT- PCR分析显示 ,该基因特异表达于小鼠淋巴相关组织中 ,而在非淋巴组织中无表达 .     

Identification and characterization of a novel cancer/testis antigen gene CAGE

We applied serological analysis of cDNA expression library technique to identify cancer-associated genes. We screened cDNA expression libraries of human testis and gastric cancer cell lines with sera of patients with gastric cancers. We identified a gene whose expression is testis-specific among normal tissues. We cloned and characterized this novel gene. It contains D-E-A-D box domain and encodes a putative protein of 630 amino acids with possible helicase activity. It showed wide expression in various cancer tissues and cancer cell lines. The corresponding gene was named cancer-associated gene (CAGE). PCR of human x hamster Radiation Hybrids showed localization of CAGE on the human chromosome Xp22. Transient transfection of CAGE showed predominantly nuclear localization. Both Western blot and plaque assay indicated seroreactivity of CAGE protein. We found that demethylation played a role in the activation of CAGE in some cancer cell lines that do not express it. Cell synchronization experiments showed that the expression of CAGE was related with cell cycle. This suggests that CAGE might play a role in cellular proliferation. Because CAGE is expressed in a variety of cancers but not in normal tissues except testis, this gene can be a target of antitumor immunotherapy.