携带荧光素酶基因肝癌细胞株的构建及在肝癌原位移植瘤模型中应用

[目的]构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞株,建立可实时观察的肝癌原位移植瘤模型。[方法]构建含有萤光素酶基因的慢病毒载体,利用慢病毒三质粒系统磷酸钙共转染HEK 293T细胞,收集纯化病毒感染肝癌细胞SMMC7721,嘌呤霉素(puromycin)结合有限稀释法筛选稳定转导细胞株,将细胞原位注射裸鼠肝组织,建立原位肝癌动物模型。[结果]包装纯化的慢病毒悬液的滴度为8.4×106TU/m L,感染肝癌细胞后成功筛选到稳定表达的肝癌细胞株。利用该细胞株成功建立原位注射肝癌裸鼠模型,经活体荧光成像系统观察到肝癌细胞在活体动物体内的分布情况。[结论]荧光素酶肝癌细胞株的成功构建及利用该细胞株建立的原位移植瘤肝癌动物模型为肝癌的治疗研究奠定了基础。     

人的恶性肿瘤连续性细胞系(株)的建系(株)标准的建议

自1952年George Gey从人的宫颈癌建立了HeLa细胞株后,国内外都陆续有不同的人癌细胞系建立的报道。由于有关各学科发展的需要,还将不断地建立新的细胞系(株)。为了使人癌细胞系(株)的鉴     

过表达Daintain促进RAW264.7细胞增殖和吞饮功能

[目的]研究过表达Daintain对巨噬细胞RAW264.7增殖和吞饮功能的影响。[方法]培养RAW264.7细胞,脂质体法导入过表达Daintain的质粒(pc DNA-DT)和空质粒(pc DNA),经G418筛选单克隆细胞株。Western Blot检测稳定转染细胞株中Daintain的表达,MTT法检测Daintain过表达对RAW264.7细胞增殖的影响,中性红染色法检测Daintian过表达对LPS诱导的RAW264.7细胞吞饮功能的影响。[结果]1对比转染pc DNA质粒的细胞株,转染pc DNA-DT质粒的细胞株中Daintian表达量增加28.7%,说明成功建立稳定过表达Daintian的RAW264.7细胞株;2在48h和72h,相对转染pc DNA的细胞株,转染pc DNA-DT的细胞株增殖明显增强;3在0.1和1μg/m L LPS诱导下,相对转染pc DNA的细胞株,转染pc DNA-DT的细胞株的吞饮作用增强。[结论]过表达Daintain促进RAW264.7细胞增殖和吞饮功能。     

MEK高表达细胞膜层析柱制备及应用

[目的]通过制备MEK高表达细胞膜色谱层析柱,建立MEK潜在抑制剂筛选方法和体系。[方法]以非小细胞肺癌细胞系A549为材料,提取总RNA,RT-PCR体外扩增mek基因,随后克隆至p EGFP-C1质粒中,脂质体转染A549细胞,G418筛选,获得稳定转染细胞株,以此稳定转染细胞株为对象,构建MEK+/+的细胞膜层析柱。最后,以MEK抑制剂AZD-6244为受测体,流动相为磷酸盐缓冲液,变性洗脱液为p H 3. 3的磷酸盐缓冲液。所得所有组分采用高效液相检测,检测条件为:Dikma C18柱(150 mm×4. 6 mm,5μm);流动相为甲醇:5 mmol/L磷酸盐缓冲液(60∶40);检测波长为203 nm;柱温为30℃;流速为1. 0 m L/min。[结果]所构建的p EGFP-C1-MEK质粒经酶切、测序鉴定,结果正确; Western Blot检测稳定转染细胞株中MEK蛋白含量较A549细胞大幅提高;高效液相检测表明AZD6244在MEK+的A549细胞膜上有保留,表明所建MEK+A549细胞膜层析柱可应用于MEK抑制剂的筛选和检测。[结论]所构建的MEK高表达细胞膜层析柱具有成为MEK潜在抑制剂筛选的潜在有效方法。     

肉桂油成分分析及肉桂醛体外抗肿瘤活性研究

目的探讨肉桂醛对不同肿瘤细胞株的生长抑制作用。方法通过水蒸气蒸馏法提取肉桂油,用气相色谱—质谱联用仪进行肉桂油成分分析;采用噻唑蓝（MTT）比色法检测肉桂醛对体外培养的人宫颈癌细胞系HeLa细胞株、人肺癌细胞系A-549细胞株和人肝癌细胞系HepG2细胞株的生长抑制作用,计算半数抑制浓度（IC50）。结果肉桂油的收率为1.96%,分析了肉桂油中的10种成分,主要为肉桂醛,占总馏出峰面积的93.94%;肉桂醛能抑制人宫颈癌细胞系HeLa细胞、人肺癌细胞系A-549细胞和人肝癌细胞系HepG2细胞增殖,且呈剂量依赖性,IC50值分为0.20、0.36和0.73 mg/mL。结论肉桂醛具有体外抗肿瘤活性。     

慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建

[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×107TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。     

高效建立129/ter、C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系的方法学探讨

小鼠胚胎干细胞 (ＥＳ细胞 )是从小鼠囊胚内细胞团(ＩＣＭ)分离出来的、在体外培养过程中可维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增殖能力 ,具有多能性或全能性的细胞系[1～ 3 ] 。ＥＳ细胞广泛应用于克隆动物制作、转基因动物生产、动物医学模型建立、真核细胞基因表达与调控的研究、细胞分化机制的探索、人及哺乳动物基因功能的研究以及细胞、组织、和器官的修复与移植研究。胚胎干细胞的研究和应用已成为生命科学研究的热点和前沿领域之一[4～ 8] 。自第一株 12 9小鼠ＥＳ细胞系建立以来 ,人们在生物学和医学等多个领域进行了广泛深入的…     

结核分枝杆菌分泌蛋白EspB 在RAW264.7细胞中的稳定表达

[目的]建立能够稳定表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白EspB(Rv3881c)的RAW264.7细胞系,为研究EspB蛋白在调控巨噬细胞功能中所起的作用提供科学依据.[方法]首先成功构建的重组质粒pEGFP-C1-EspB,然后将重组载体pEGFP-C1-EspB和空载体pEGFP-C1以脂质体介导的方法转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中,经过G418筛选后建立稳定表达EGFP-EspB融合蛋白以及EGFP的细胞系,并通过RT-PCR、荧光显微镜及Western blot方法,在基因和蛋白两个水平对所建立的稳转细胞系进行鉴定.[结果]EGFP-ESAT6融合基因成功整合入RAW264.7细胞基因组并能够稳定表达,成功获得了能够稳定表达EGFP-EspB融合蛋白以及EGFP的细胞系.[结论]本试验利用脂质体介导的方法,将构建的重组载体pEGFP-C1-EspB和空载体pEGFP-C1转染至Raw264.7细胞系中,获得了稳定表达EGFP-EspB融合蛋白的巨噬细胞系,为阐明EspB分泌蛋白在调控巨噬细胞功能中所起的作用以及EspB与巨噬细胞蛋白之间的相互作用提供了研究平台.     

SIVp27单克隆抗体的制备和鉴定

[目的]建立SIVp27杂交瘤细胞株,并对其分泌的SIVp27单克隆抗体进行初步鉴定。[方法]使用基因重组的SIVp27蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术使用半固体培养基法建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。通过染色体核型对杂交瘤细胞株进行鉴定;采用Westernblot、免疫荧光法、酶联免疫吸附法确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、抗原识别表位、免疫球蛋白的类型和亚类,对单克隆抗体进行鉴定。[结果]获得四株可稳定分泌SIVp27单克隆抗体的杂交瘤细胞,1C3、2B6为IgG1类,2E12为IgG2b类,3G3为IgG2a类。四株单抗均能识别SIV的p27蛋白,与逆转录病毒SRV、STLV无交叉反应,2B6、2E12与HIVp24有交叉反应。免疫荧光法检测腹水效价为1:10240~40960。1C3、2B6、2E12、3G3染色体平均数分别为103、97、96、101。2E12与3G3识别不同的抗原表位。[结论]成功地制备出四株SIVp27单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立免疫分析方法,进行SIV/SAIDS及其艾滋病相关研究,奠定了基础。     

稳定表达貉犬瘟热病毒细胞受体SLAM的Vero细胞系的建立及应用

[目的]信号淋巴激活分子(SLAM又称CD150)为犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的细胞受体.本研究目的在于建立稳定表达犬瘟热易感动物貉SLAM基因的Vero细胞系,用于犬瘟热诊断及CDV强毒株的快速分离.[方法]从重组质粒pMD-18-T-rSLAM扩增rSLAM基因编码区,通过分子克隆技术构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-rSLAMhis.将该质粒转染Vero细胞后,经EGFP荧光观察、G418抗性压力和单细胞克隆化及RT-PCR筛选表达rSLAM阳性细胞系.应用获得细胞系对临床犬瘟热病例进行病毒分离,对分离得到CDV进行RT-PCR鉴定及动物回归试验.[结果]经过RT-PCR和免疫组化试验证实,本实验筛选获得一株能稳定表达rSLAM的Vero细胞系——Vero-rSLAM.该细胞系接种CDV阳性样品36-48h即可产生典型CDV致细胞融合病变,而其亲本Vero细胞接种至6d均无可见细胞病变出现.应用Vero-rSLAM细胞系从狐狸、貉犬瘟热阳性病料中分离获得了3株犬瘟热病毒.其中犬瘟热病毒LN(10) f1株对易感狐狸、貉均可产生致死性感染.[结论]成功建立了稳定表达rSLAM的Vero细胞系,用它分离的CDV对本动物保持较强的毒力.