黑暗链霉菌中新脱氢酶基因的克隆与功能初步研究

S.tenebrarius H6主要产生安普霉素、氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B,其中后两者仅在3′位有差异。为克隆相关基因,根据已报道的aprD3、livY、gentY基因设计兼并性PCR引物,并采用SON-PCR(singleoligonucleotide nested PCR)方法和LASP-PCR(linear amplification single primer PCR)方法,扩增获得部分SCD1基因,Blast分析为短链脱氢酶基因。采用基因阻断技术,使S.tenebrariusH6中SCD1基因失活。与野生菌株相比,变株的抗生素组分和含量几乎没有变化,但变株产孢子能力下降,且产孢子时间推迟,推测该基因与孢子的生成调节相关。     

单组分妥布霉素产生菌的快速筛选

经多轮筛选获得了 1株妥布霉素耐药安普霉素敏感的芽孢杆菌。利用该菌与枯草杆菌 6 35 0 1混合作为检定菌 ,从妥布霉素和安普霉素二组分产生菌中快速筛选到了单组分妥布霉素产生菌。     

格尔德霉素生物合成基因功能的验证

格尔德霉素(Geldanamycin, Gdm)作为热休克蛋白90的特异性抑制剂, 是非常有前景的抗肿瘤和抗病毒的药物,我们已从吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)的基因文库中获得了Gdm大部分生物合成基因。为了研究主要基因的功能, 选择了聚酮合酶基因(Polyketide synthase gene, pks)的第六模块、单加氧酶基因(Mono-oxygenase gene, gdmM)和氨甲酰基转移酶基因(Carbamoyltransferase gene, gdmN)3个基因作为靶点分别进行基因阻断, 获得了基因同源双交换的阻断变株△pks、△gdmM和△gdmN。经HPLC检测证实这些基因的阻断变株均不产生Gdm, 基因回复实验排除了基因阻断所可能造成的极性效应对其它基因表达的影响, 说明所克隆的pks、gdmM和gdmN基因确实是Gdm生物合成所必须的基因。     

硫霉素生物合成酶基因克隆的研究

利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y₃。通过对Y3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S．Cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y₃变株恢复产生硫霉素的酶基因。根据对Y₃积累的中间产物的分析,认为该酶基因可能与硫霉素生物合成过程中肽的环化作用有关。重组质粒分子大小为9．8kb左右,插入片段大小为4．5kb,分子杂交试验证明插入片段来源于硫霉素产生菌S．Cattleya。     

糖基转移酶基因双敲除对依博素生物合成的影响

以往研究已确定链霉菌胞外多糖依博素的生物合成基因簇(ste), ste15 和ste22 分别编码葡萄糖糖基转移酶和鼠李糖糖基转移酶。现通过基因同源重组双交换,在ste15基因缺失突变株Streptomyces sp. 139 (ste15-) 基础上,再进行ste22 基因阻断,经Southern 杂交验证,得到了ste15 和ste22 双基因缺失突变株Streptomyces sp. 139 (ste15-ste22-),并对该菌株进行了基因互补研究。双基因缺失株产生的胞外多糖与依博素相比,葡萄糖与鼠李糖含量明显降低,分子量下降,生物活性明显变弱。基因互补株产生的胞外多糖中葡萄糖与鼠李糖含量基本恢复至依博素水平,生物活性也显著提高。因此,进一步阐明了ste15和ste22基因参与了依博素生物合成中葡萄糖和鼠李糖重复单元序列的形成过程,在依博素的生物合成中起重要作用,变株产生的依博素新衍生物体内外生物学活性正在深入研究中。     

圈卷产色链霉菌san7324和san7324L基因阻断对形态分化和尼可霉素产生的影响

【目的】圈卷产色链霉菌全局性调控基因wblA阻断突变后,尼可霉素不再产生。RNA-seq和转录分析表明san7324基因在野生型菌株中可以正常转录,而在wblA阻断突变株(ΔwblA)中不能转录,为此本文旨在揭示san7324与尼可霉素产生的关系。【方法】利用同源双交换策略对san7324进行基因阻断,而后通过基因遗传回补及对尼可霉素生物合成相关基因的转录分析等方法研究san7324的功能。【结果】在相同培养条件下,阻断突变株Δsan7324与野生型菌株相比失去了合成尼可霉素的能力。我们通过同源比对发现圈卷产色链霉菌中还存在一个与san7324同源的基因san7324L,该基因的阻断导致尼可霉素产量降低。当san7324和san7324L两个基因同时被阻断后,得到的突变株Δsan7324-san7324L生长稀疏而且不能正常发育分化形成灰色表型的孢子或孢子链,只能形成白色表型的气生菌丝,同时也丧失了合成尼可霉素的能力。当这两个基因(san7324-san7324L)回补双突变株后,则恢复了野生型的表型(能形成孢子链并恢复尼可霉素的产生)。进一步的研究初步表明san7324和san7324L的阻断主要影响了尼可霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因sanG的转录水平,从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素的产生。【结论】该结果为链霉菌形态分化与生理代谢关系的研究提供了更多的证据,同时为多效调控基因wblA作用机制的阐明奠定了基础。     

产生妥布拉霉素的ER-16突变株的选育

以妥布拉霉素产生菌暗黑链霉菌AS 4.1098(410-Ⅱ)为出发菌株,经高温和亚硝基胍处理,获得6株无色突变株,对其中的W1028-M5用亚硝基胍及甲基磺酸乙酯继续处理,得到突变株E228,再经抗自身代谢终产物妥布拉霉素抗性株的选育,得到ER-16和ER-21等高产菌株。所产抗生素仅含两个组份,即氨甲酰妥布拉霉素和阿普拉霉素。不再含氨甲酰卡那霉素。测定的几项主要理化性质与出发菌株以及文献报道的数据完全一致。     

产生妥布拉霉素的ER—16突变株的选育

以妥布拉霉素产生菌暗黑链霉菌AS 4.1098(410-Ⅱ)为出发菌株,经高温和亚硝基胍处理,获得6株无色突变株,对其中的W1028-M5用亚硝基胍及甲基磺酸乙酯继续处理,得到突变株E228,再经抗自身代谢终产物妥布拉霉素抗性株的选育,得到ER-16和ER-21等高产菌株。所产抗生素仅含两个组份,即氨甲酰妥布拉霉素和阿普拉霉素。不再含氨甲酰卡那霉素。测定的几项主要理化性质与出发菌株以及文献报道的数据完全一致。     

卡西霉素生物合成调控基因calR2的功能

【背景】卡西霉素(Calcimycin)是由教酒链霉菌NRRL3882产生的吡咯聚醚类抗生素,结构独特且具有广泛的生物活性,但其生物合成调控机制尚不清楚。【目的】研究卡西霉素生物合成基因簇上编码LuxR家族同源蛋白的潜在调控基因calR2的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法对卡西霉素基因簇上的calR2基因进行中断,HPLC对突变株及回补菌株的代谢产物进行分析。利用荧光定量RT-PCR分析ΔcalR2突变菌株和野生菌株的基因转录水平差异。【结果】calR2基因中断的突变株不能产生卡西霉素,回补菌株则恢复产生卡西霉素的能力。RT-PCR结果表明卡西霉素生物合成的一些重要骨架基因在ΔcalR2突变株中的转录水平明显降低。【结论】LuxR家族转录调控基因calR2在卡西霉素生物合成过程中起正调控作用。     

黑暗链霉菌DNA同源重组系统的构建

以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprF-G的上、下游序列,作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因筛选标记及其启动子插入两交换臂之间,以温敏型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49安普霉素生物合成的重组质粒pFD8.该质粒通过E.coil ET12567/pUZ8002去甲基化修饰后,经接舍转移进入黑暗链霉菌Tt-49,利用红霉素抗性筛选得到3株阳性转化子,分别命名为Tt-49 AG1、Tt-49 AG2和Tt-49 AG3.通过PCR鉴定,证明pFD8已插入黑暗链霉菌Tt-49基因组的目标位点.以亲株作对照,对3株工程菌进行红霉素抗性能力考察,发现3株工程菌的抗红霉素能力均高迭1 000 μg/mL以上.     

链霉菌Streptomyces tenebrarius H6中与抗生素有关的糖生物合成基因的克隆

链霉菌S.tenebrarius H6产生多种氨基糖甙类抗生素,主要有阿普霉素、妥普霉素及卡那霉素B,其中阿普霉素因含有8碳糖的一种特殊结构令人注目,它的抗菌谱广,特别是对革兰氏阴性菌有较强的抗菌活性,不容易产生耐药性,对已有的耐药菌产生的氨基糖苷转移酶等失活酶仍有抵抗力.主要用于牛、猪、鸡等的大肠杆菌、沙门氏菌和支原体所引起的白痢、腹泻和肺炎等疾病.迄今有关八碳糖生物合成基因簇的研究在国内外尚无报道,在该菌株开展有关糖合成代谢基因的研究有着一定的意义.     

Isolation and characterization of the tobramycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces tenebrarius

The biosynthetic gene cluster for tobramycin, a 2-deoxystreptamine-containing aminoglycoside antibiotic, was isolated from Streptomyces tenebrarius ATCC 17920. A genomic library of S. tenebrarius was constructed, and a cosmid, pST51, was isolated by the probes based on the core regions of 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) synthase, and L-glutamine:DOI aminotransferase and L-glutamine:scyllo-inosose aminotransferase. Sequencing of 33.9 kb revealed 24 open reading frames (ORFs) including putative tobramycin biosynthetic genes. We demonstrated that one of these ORFs, tbmA, encodes DOI synthase by in vitro enzyme assay of the purified protein. The catalytic residues of TbmA and dehydroquinate synthase were studied by homology modeling. The gene cluster found is likely to be involved in the biosynthesis of tobramycin.     

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌lat基因插入突变的重组质粒pELA

本实验将PCR所得的1.8kb的lat基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat,经EcoRI-HindⅢ双酶切后得到lat基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌lat基因的序列及质粒pIJ77(3 pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒)中阿泊拉抗性基因(aac(3)iv)的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的lat基因两端的互补序列,以质粒pIJ773为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有lat基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的lat基因同源序列与pGH112-lat中的野生型lat基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入lat基因中,得到lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌lat基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。     

Engineering Streptomyces tenebrarius to synthesize single component of carbamoyl tobramycin

Aims: To engineer Streptomyces tenebrarius for producing carbamoyl tobramycin as a main component. Methods and Results: The aprH‐M gene fragment (apramycin biosynthetic gene from GenBank) in S. tenebrarius Tt49 was knocked out by genetic engineering to form S. tenebrarius T106 (△aprH‐M). Compared to the wild‐type strain, mutant strain T106 (△aprH‐M) no longer produced apramycin, while mainly synthesize carbamoyl tobramycin. TLC and HPLC‐MS analyses indicated that the mutant strain significantly increased the production of carbamoyl tobramycin. Conclusions: The metabolic flow for the apramycin and its analogues biosynthesis was blocked by disrupting the aprH‐M gene clusters. The aprH‐M gene clusters might be essential for the biosynthesis of apramycin. The mutant strain T106 mainly synthesized carbamoyl tobramycin. Significance and Impact of Study: The mutant T106 mainly produces carbamoyl tobramycin without synthesizing apramycin, which will reduce cost of postextraction from fermentation products. Therefore, it has good prospects for industrial application.     

柔红霉素产生菌SIPI-1482中dnmV基因功能的阻断及恢复

dnmV基因产物为柔红霉素生物合成途径中TDP-6-脱氧己糖C4酮基还原酶,破坏该基因能阻断柔红糖胺的合成,进而阻断柔红霉素的产生。从天蓝淡红链霉菌(S. coeruleorubidus)SIPI-1482基因组DNA中经PCR扩增出dnmV及其上游dnmU基因片段,并由此构建了用于阻断dnmV基因的同源重组质粒pYG817,转化SIPI-1482菌株后成功地破坏了dnmV基因,发酵结果显示阻断突变株不再代谢产生柔红霉素,为引入新的基因来改变代谢产物的糖基结构打下了基础。通过导入dnmV基因表达质粒可重建该突变株的生物合成途径,恢复产生柔红霉素,但产量比出发菌株要低。     

龟裂链霉菌zwf2基因阻断提高土霉素生物合成

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是链霉菌磷酸戊糖途径中第一个酶("看家"酶),也是形成NADPH的关键酶,由zwf1和zwf2基因编码.以温敏型质粒pKC1139为基础构建了用于阻断龟裂链霉菌zwf2的重组质粒pKC1139-zwf2',通过大肠杆菌GM2929去甲基化pKC1139-zwf2'后电转至原始龟裂链霉菌M4018感受态细胞,筛选得到转化子.转化子进一步通过PCR鉴定和点杂交印迹分析鉴定,证明是zwf2基因阻断的阳性突变子命名为M4018-△zwf2.以原始菌株为对照,突变子摇瓶发酵结果表明:突变子的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活是原始菌的50%左右,但土霉素生物合成水平则提高了27%;在细胞生长方面,二者均在第4d进入生长稳定期而开始大量合成土霉素,发酵结束时细胞菌体浓度基本相同,但突变子的单位菌丝体土霉素生物合成能力则提高了31%.因此,zwf2的阻断有利于土霉素的生物合成,而对细胞生长没有明显影响.     

黑暗链霉菌DNA转移系统的建立

研究了黑暗链霉菌的基因转移系统,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向黑暗链霉菌中转入外源DNA的可能性。多次尝试用质粒pIJ702转化黑暗链霉菌9904原生质体均未成功。对原生质体进行“热处理”后转化、利用单链DNA转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中,表明黑暗链霉菌对外源DNA有很强的限制修饰作用。利用接合转移将具有oriT的大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pHZ132转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,获得供体菌ET12567(pUZ8002,pHZ132)。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌9904的孢子进行接合转移,成功地将pHZ132转入黑暗链霉菌9904中。质粒pHZ132经黑暗链霉菌自身修饰后也可转入黑暗链霉菌9904菌株的原生质体中,转化率约为103/μg DNA(pHZ132)。