离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯代盐对溶菌酶结晶的影响

以亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(BmimCl)为添加剂,研究离子液体对溶菌酶结晶的影响.分别考察了离子液体对溶菌酶晶体数量与尺寸、晶体形貌及蛋白质纯度的影响,并探讨了离子液体对结晶过程影响的作用机制.离子液体通过增大溶菌酶的溶解度和其自身低蒸气压两种途径,降低了溶菌酶在结晶过程中的过饱和度,更有利于晶体的成核和生长,得到更好的结果.如避免多晶态现象的发生,增大晶体的尺寸,降低溶菌酶样品纯度的要求.X-射线衍射分析表明,离子液体未改变晶体的晶型结构,但可提高晶体的衍射分辨率.     

不同重力条件下生长的溶菌酶晶体的结构

利用我国返回式卫星和国内研制的蛋白质结晶装置 ,先后进行了 2次空间蛋白质晶体生长实验 ,均获得了质量较好的溶菌酶晶体 .为了探索微重力对溶菌酶晶体结构的影响 ,对 2次空间生长的和地面实验室生长的溶菌酶晶体进行了高精度的晶体结构测定和研究     

凝胶法生长溶菌酶晶体的研究

凝胶介质可以排除或削弱晶体生长过程中重力引起的对流和沉淀现象,用凝胶法生长生物大分子晶体是一种新的探索。使用类似于悬滴汽相扩散的方法,凝胶中生长出单个较大的外形发育完善且高度对称的鸡蛋清溶菌酶晶体。ＭＰＤ在凝胶中对溶菌酶结晶与溶液中具有相似的抑核作用。排循照像实验表明,凝胶法生长的晶体具有较强的衍射能力。     

超临界CO_2诱导双酚A型聚碳酸酯预聚体的结晶行为

采用超临界CO_2技术对不同数均分子量(M_n)的双酚A型聚碳酸酯预聚体进行诱导结晶,应用热分析(DSC)、广角X射线衍射(WAXD)、扫描电子显微镜(SEM)对诱导结晶后的聚碳酸酯进行了结构和形貌的表征。研究表明,预聚体经超临界CO_2诱导结晶形成同一晶型、尺寸不同的片状晶体,片晶随着诱导结晶时温度、压力的升高逐渐增厚,结晶度增大。在二氯甲烷、乙醇和丙酮三种共溶剂中,极性最大的丙酮诱导的晶体结晶度最大。随M_n的增大,结晶度减小。同时广角X射线衍射结果也证实了超临界CO_2诱导的聚碳酸酯的晶体是单斜晶系结构。     

溶菌酶分子聚集状态对蛋白质晶体生长影响的研究

使用动态光散射仪及微批量法,实时测量了溶菌酶晶体生长过程中,蛋白质颗粒的聚集情况。实验表明当液滴中的溶菌酶分子单体形式占多数,同时也存在一定数目的聚集体时,将会产生晶体。另外还通过观察有无絮状物附着情况下,溶菌酶晶体的生长情况,研究了絮状物对晶体生长速度的影响。实验表明这种由高密度的蛋白质聚集体组成的絮状物附着在晶体表面时,晶体的生长受到抑制。而絮状物会逐渐解体,重构成四方晶体或球状结晶等更稳定的聚集状态。研究在一定程度上揭示了溶液中溶菌酶分子的聚集状态与结晶的关系。     

限制性酶切提高E.coli Hfq蛋白晶体结构分辨率

Hfq蛋白是一种促进sRNA结合互补RNA的细菌伴侣蛋白. Hfq蛋白可以抑制或上调目的蛋白的表达及促进mRNA的降解,从而调控细菌的生理功能使其适应周围胁迫环境.Hfq是同源六聚体蛋白质,在其中心部位有1个内环,每个单体上有1个极其保守的组氨酸分布在这个内环表面.根据Hfq这个特点,应用镍离子亲和柱直接从大肠杆菌中纯化Hfq,接着用凝胶过滤层析柱纯化,最终获得了纯度70%的Hfq蛋白.对该蛋白质进行结晶条件初筛前,应用胰凝乳蛋白酶对其进行限制性蛋白酶解,切除其C端无规则卷曲,便于Hfq结晶及提高晶体衍射率.初期得到的Hfq晶体是极小的针状晶体,通过优化结晶条件获得了较大的晶体.最终解析出了2个分辨率较高的Hfq晶体结构,其中1个晶体结构分辨率达到了1.63A.     

限制性蛋白酶解提高E.coli Hfq蛋白晶体结构分辨率

Hfq蛋白是一种促进sRNA结合互补RNA的细菌伴侣蛋白.Hfq蛋白可以抑制或上调目的蛋白的表达及促进mRNA的降解,从而调控细菌的生理功能使其适应周围胁迫环境.Hfq是同源六聚体蛋白质,在其中心部位有1个内环,每个单体上有1个极其保守的组氨酸分布在这个内环表面.根据Hfq这个特点,应用镍离子亲和柱直接从大肠杆菌中纯化Hfq,接着用凝胶过滤层析柱纯化,最终获得了纯度70%的Hfq蛋白.对该蛋白质进行结晶条件初筛前,应用胰凝乳蛋白酶对其进行限制性蛋白酶解,切除其C端无规则卷曲,便于Hfq结晶及提高晶体衍射率.初期得到的Hfq晶体是极小的针状晶体,通过优化结晶条件获得了较大的晶体.最终解析出了2个分辨率较高的Hfq晶体结构,其中1个晶体结构分辨率达到了1.63.     

利用数字图象技术观察蛋白质的结晶过程

用汽相扩散法生长溶菌酶晶体并利用ＣＣＤ显微摄像系统记录了溶菌酶晶体的生长过程。由此图象序列,我们可以计算晶体的最大线度、生长速度,估计溶菌酶分子层的增长速度,了解蛋白质晶体在结晶室内的分布及其形态变化。得到结果如下：蛋白晶体生长初期最大线度与时间近似成线性关系;各晶面生长速度基本相等。     

制备用于结晶的蛋白质样品

制备高质量蛋白质晶体是通过X射线衍射解析蛋白质分子三维结构的关键环节,是结构生物学领域中的瓶颈问题之一。蛋白质的结晶受多因素控制,其中蛋白质样品自身的质量是影响蛋白质能否结晶及晶体质量好坏的关键因素。我们从蛋白质纯度、可溶性、均一性及表面修饰等方面介绍了如何获得适于结晶的蛋白质样品,以及如何借助相关仪器检测蛋白质样品的质量,预测蛋白质的可结晶性。     

溶菌酶的结晶研究

介绍了溶菌酶结晶的意义,通过对晶核形成、晶体生长和停止生长三个阶段的论述,详细地阐述了溶菌酶的结晶机理;并综述了结晶过程中的各个影响因素:蛋白质浓度、pH值、添加剂、生长温度及重力场、磁场等;展望了溶菌酶结晶研究的发展趋势和发展前景。