鸡传染性法氏囊病上海超强毒株NH99的分离与鉴定

通过对上海近郊某鸡场数群10日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检测及病毒核酸纯化、VP2基因序列的测定与分析,确认上海地区以发病日龄早,发病率、死亡率高为特征的鸡传染病为超强毒型鸡传染性法氏囊病,病原具有鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)的分子特征,为vvIBDV.     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒上海株SH95基因组B片段的克隆与分子系统进化树分析

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)上海株(SH95)的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将RNA反转录成cDNA,以此为模板一步扩增出全长基因组B片段,将其克隆入pGEM—T载体,并进行序列分析。克隆的B片段全长2827个核苷酸,其编码的氨基酸与超强毒株HK46的同源性达98．18％(863／879)。分子系统进化树分析表明,SH95超强毒株与美国变异株E的亲缘关系最近,但与基于基因组A片段的系统进化分析完全不同,表明该毒株在发生过程中基因重配比基因重组发挥了更重要的作用。通过对14株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较,推测B片段上11个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株GX8/99株的致病性

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒株GX8/99,系1999年从广西一自然发病鸡群采集到.用原始病鸡法氏囊悬液连续3次人工感染SPF鸡后,再取其法氏囊制备悬液,分装,在-70℃保存.以此悬液经卵黄囊接种10日龄SPF鸡胚,测定鸡胚的半数致死量(ELD50).随着鸡的日龄和接种剂量的不同,其致死率有很大差异.对28～30日龄SPF鸡,病毒接种量为200个ELD50时,感染后7日内死亡率最高可达73%～90.5%(11/15和19/21);感染量为20个ELD50时,死亡率亦可达53%～92%(8/15和23/25).以500个ELD50感染28～104日龄的SPF鸡,死亡率均在55.1%～67.2%;甚至113～120日龄的SPF鸡,感染后仍有10%～15%致死率.但128日龄的SPF鸡感染后既不引起死亡也不表现任何症状,但抗体全部转阳.人工接种发病死亡的鸡,其法氏囊的出血程度也随感染量和年龄而异.50日龄鸡接种2000个ELD50后,死亡的鸡100%(12/12)法氏囊严重出血;而40日龄鸡感染200个ELD50后,死亡鸡中仅17%(3/18)发生出血.在2、3、4周龄带有母源抗体的商品代蛋鸡,以2000个ELD50病毒接种后,只引起10%(2/20)、35%(7/20)和35%(7/20)的死亡率.但在5周龄商品代蛋鸡,仅接触感染的致死率可达61.3%(98/160).另一批商品代蛋鸡,在4周龄和5周龄人工接种200个ELD50病毒后,死亡率分别是81.6%～94.3%(62/76～33/35)和93.9%～94%(31/33～47/50).通过总共1200多羽鸡的试验表明,GX-8/99株是一个超强毒IBDV毒株,表现为高死亡率(最高可达94%),易感年龄延长至4月龄,中枢性免疫器官法氏囊出血严重和胸腺明显萎缩.     

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的。 1 基因组结构和功能 IBDV基因组由A(3.2kb)、B(2.8kb)两个双链RNA节段构成。A编码形成VP2蛋白(37-40k…     

传染性法氏囊病超强毒山东分离株SD0210的致弱研究

本研究将鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)SD0210株经SPF鸡胚培育及鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养,获得了对CEF适应的细胞毒,并对细胞毒进行了致病性、回归动物的稳定性试验及免疫原性方面的试验,结果表明已成功获得了具有髙免疫原性且安全无毒力返强的致弱株,并初步揭示了vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化过程中,VP2高变区氨基酸序列的变化情况。SD0210株培养至18代开始适应细胞,出现细胞病变。21代细胞毒已对SPF鸡失去了致病性,在鸡体内连续传代15代毒力不返强,而且具有较高的免疫原性。     

传染性法氏囊病超强毒山东分离株SD0210的致弱研究

本研究将鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)SD0210株经SPF鸡胚培育及鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养,获得了对CEF适应的细胞毒,并对细胞毒进行了致病性、回归动物的稳定性试验及免疫原性方面的试验,结果表明已成功获得了具有高免疫原性且安全无毒力返强的致弱株,并初步揭示了vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化过程中,VP2高变区氨基酸序列的变化情况.SD0210株培养至18代开始适应细胞,出现细胞病变.21代细胞毒已对SPF鸡失去了致病性,在鸡体内连续传代15代毒力不返强,而且具有较高的免疫原性.     

一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2—4—3基因

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)上海株SH95的病毒核酸dsRNA ,应用随机引物将RNA反转录成cDNA ,以此为模板一步扩增出A片段前体融合蛋白基因即VP2 4 3基因 ,将其克隆入 pGEM T载体 ,并进行序列分析 ,其与超强毒株HK4 6的核苷酸序列的同源性达 98% ,整个基因有 5个氨基酸差异 ,同源性达99.5 1% (10 0 7/ 10 12 )。     

一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2-4-3基因

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV) 上海株SH95的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将RNA反转录成cDNA,以此为模板一步扩增出A片段前体融合蛋白基因即VP2-4-3基因,将其克隆入pGEM-T载体,并进行序列分析,其与超强毒株HK46的核苷酸序列的同源性达98%,整个基因有5个氨基酸差异,同源性达99.51%(1007/1012).     

传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

以5株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)单克隆抗体HNF1、HNF7、B34、2B1和2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,用间接ELISA检测,A值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位.选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列.进一步将其与GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu-Ala-Ser-Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1、HNF7、B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位.     

传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

以5株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)单克隆抗体HNF1、HNF7、B34、2B1和2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,用间接ELISA检测,A值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位。选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gIII部分基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列。进一步将其与GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu-Ala-Ser-Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1、HNF7、B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位。     

IBDV多聚蛋白基因真核表达质粒的构建与表达

将IBDV上海超强毒株的多聚蛋白基因(vp2-4-3)克隆入真核表达载体pALTER-MAX,构建成功pALTER-MAX-VP2-4-3真核表达质粒,经纯化后,pALTER-MAX-VP2-4-3在LipofectamieTM 2000介导下转染Vero细胞、11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)和肌肉注射2日龄的雏鸡,1周后,分别提取细胞或组织中的总DNA或总RNA,用DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号;转染的Vero细胞飞片和肌肉冰冻切片,进行免疫荧光检测均呈现阳性结果;转染的鸡胚CAM匀浆上清,用兔抗IBDV超强毒的高免血清,经Dot-ELISA检测呈现阳性.表明转染后基因获得表达,表达的蛋白具有免疫反应性.     

IBDV多聚蛋白基因真核表达质粒的构建与表达

将IBDV上海超强毒株的多聚蛋白基因(vp2-4-3)克隆入真核表达载体pALTER-MAX,构建成功pALTER-MAX-VP2-4-3真核表达质粒,经纯化后,pALTER-MAX-VP2-4-3在Lipofectamie^TM2000介导下转染Vero细胞、11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)和肌肉注射2日龄的雏鸡,1周后,分别提取细胞或组织中的总DNA或总RNA,用DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号;转染的Vero细胞飞片和肌肉冰冻切片,进行免疫荧光检测均呈现阳性结果;转染的鸡胚CAM匀浆上清,用兔抗IBDV超强毒的高免血清,经Dot—ELISA检测呈现阳性。表明转染后基因获得表达,表达的蛋白具有免疫反应性。     

传染性法氏囊病病毒感染性克隆的快速构建

用长距离RT PCR一步扩增并克隆全长为 2 82 7bp的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的B节段基因组cDNA ,通过定点的沉默突变在B节段编码区引入一个EcoRV酶切位点作为分子标记。分别构建IBDV的A、B节段基因组真核表达载体 ,在脂质体介导下共转染Vero细胞。RNA点杂交、间接免疫荧光分析表明重组子在Vero细胞得到了表达 ;用转染细胞的培养上清液不断地接种新的Vero细胞 ,模拟病毒“传代” ,观察到细胞形态学发生变化 ,产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应 (CPE) ;电子显微镜下可以看到符合IBDV病毒粒子结构的物质 ;酶切鉴定验证了所引入的分子标记 ,证实人工IBDV获得拯救。建立的基于长距离RT PCR和RNA聚合酶Ⅱ系统的快速、简易的IBDV感染性克隆构建方案 ,为开发新一代抗IBDV的基因缺失疫苗创造了条件。