以gfp为报告基因的肺炎链球菌启动子诱捕文库的构建与分析

首先构建一个以gfp(green fluorescence protein)为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP,将肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段(200bp～800 bp)克隆到该质粒gfp基因上游的多克隆位点,得到约58000个含有肺炎链球茵基因组DNA随机酶切片段的重组子,提取质粒即为质粒库,该库大约覆盖肺炎链球菌基因组全长的5倍,插入率达到90%以上,且有较强的随机性,质量较高.将该质粒库转化入肺炎链球菌TIGR4菌株,带有随机片段的报告质粒通过同源重组的方式将gfp基因融合于细菌染色体上该随机片段之后,利用质粒的抗生素抗性基因筛选出重组菌株,从而构建出相应的菌株库,共获得包含约500000个肺炎链球菌转化子的菌株库,经体内、外实验表明,其包含插入了S.pn体内、外表达基因片段的细菌,可以报告特定条件下的基因表达,并可通过流式细胞仪识别、分选.该文库的构建为进一步利用差异荧光诱导技术筛选肺炎链球菌体内诱导基因奠定了基础.     

影响肺炎链球菌感受态形成的双组分系统

肺炎链球菌在生长过程中可自发形成感受态,从而改变自身的毒力和生存能力,以适应环境的变化。肺炎链球菌的部分双组分系统与其感受态形成密切相关,对相关双组分系统的研究可为进一步探索肺炎链球菌感受态形成机制、深入理解肺炎链球菌的致病机制和耐药机制提供理论依据。     

肺炎链球菌相关毒力因子及其作用的研究进展

肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)是导致黏膜疾病(如中耳炎、肺炎)和系统性疾病(包括败血症和脑膜炎)等严重疾病的主要病原体之一。肺炎链球菌毒力因子分为荚膜多糖、S.pn相关蛋白、细胞壁及细胞壁多糖三大类,其中荚膜多糖为最主要的毒力因子,也是疫苗中最有效的成分。毒力因子在S.pn入侵机体及引发疾病的过程中起着重要的作用。因此,毒力因子及作用的研究,不仅对预防和治疗肺炎链球菌的感染有着重要的意义,并为研发安全、有效的多糖疫苗提供一定的技术支持。现就肺炎链球菌毒力因子及其作用作一综述。     

转gfp基因大麦中gfp基因表达的半定量RT-PCR方法分析

本研究以5种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦的不同株系(A,B,C,D,F)及野生型Igri为材料,对供试材料的叶片中gfp基因的荧光表达量利用荧光显微镜测定,并对各株系进行半定量RT-PCR分析。研究结果表明:5种转基因大麦叶片的gfp基因荧光表达量不同,检测结果为FA≈B≈CD;同一转基因材料(C、F)的gfp基因表达存在组织差异,其花粉、叶片及根尖等不同器官中的gfp表达强度不同;转gfp基因D系的gfp基因沉默是gfp基因在转录水平失活。     

肺炎链球菌体内诱导基因的筛选及初步鉴定

为筛选鉴定肺炎链球菌宿主体内诱导的基因,寻找潜在的抗生素作用靶点和疫苗候选者,应用体内表达技术,以肺炎链球菌荚膜合成的关键基因galU作为体内报告基因,利用其缺陷体不能合成荚膜多糖,从而不能在宿主体内存活的特点,筛选鉴定肺炎链球菌体内诱导基因。首先,把肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段(200~500bp)克隆到含有体内、体外双重报告基因(galU-lacZ)的报告载体pEVP3-galU的BglⅡ位点,将获得的质粒库转化肺炎链球菌galU缺陷菌株,得到肺炎链球菌体内启动子诱捕文库,将此文库去感染BALB/c小鼠,经过两轮体内筛选,在涂布有X-gal的TSA血清平板上得到了165个白色菌落,对插入的随机片段进行测序及生物信息学分析,共证实15个不同的体内诱导基因片段,8个为单独的ORF,7个为含有多个ORFs的操纵子结构,它们分别参与细菌在宿主体内的定植与粘附、能量代谢、物质转运、转录调节、DNA复制与重组、细胞壁合成等,另外还包括功能不明的假想蛋白。其中部分ORFs可能与细菌毒力相关,可以作为候选疫苗和药物的靶标。     

肺炎链球菌粘附和毒力因子A研究进展

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,SP）普遍定植于呼吸道,是人类重要的侵袭性病原菌之一,是社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症、鼻窦炎的主要病原菌。肺炎链球菌粘附和毒力因子A（pneumococcal adherence and virulence factor A,PavA）是肺炎链球菌早期感染和侵袭过程中关键的毒力因子。体外试验表明,缺失PavA的肺炎链球菌的突变株其粘附和侵入上皮细胞和内皮细胞的能力明显下降。作为一种保护性抗原,其诱导的细胞和体液免疫可以有效的抵抗肺炎链球菌的感染,是肺炎链球菌新一代疫苗的候选蛋白。但是,PavA在肺炎链球菌与人肺上皮细胞交互对话中作用机制的研究尚属空白,本文就肺炎链球菌粘附和毒力因子A得最新研究进展作一综述。     

蛹虫草hat启动子的克隆及功能分析

从蛹虫草中克隆出1个组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferase)基因的hat启动子,长度为1 509 bp,并对该启动子的序列进行详细分析。依据作用元件预测结果显示,hat启动子含有CAAT-box和TATA-box等典型的顺式作用元件,以及参与光响应的顺式作用元件G-box,参与水杨酸响应的顺式作用元件SARE等。将hat启动子连接于报告基因绿色荧光蛋白基因gfp (Green fluorescence gene)的上游,与gfp融合基因表达构建来鉴定启动子的活性。经过农杆菌转化,得到的疑似转化子进行PCR验证、gfp表达水平分析及荧光检测,结果表明：该启动子在蛹虫草菌丝中有较强的驱动GFP表达的能力,在荧光显微镜下可以观察到转化子具有强烈的绿色荧光。开展此研究为食用菌菌种改造提供启动子元件及建立高效的蛹虫草异源基因表达体系奠定基础。     

香菇印gpd-Le和ras-Le启动子的功能分析

利用从香菇菌丝体中克隆的启动子片段gpd-Le(613bp)和ras-Le(715bp)分别连接于报告基因gfp(绿色荧光蛋白基因)的上游,构建了启动子功能活性检测表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp分别与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测。结果表明:香菇gpd-Le启动子在灰盖鬼伞的菌丝中具有较强驱动外源gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察到gfp基因表达的绿色荧光。而香菇ras-Le启动子没有检测到有驱动外源gfp基因表达的活性。     

染色体重组对转基因大麦中gfp基因表达的作用

利用5种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦不同株系及野生型大麦为材料,对不同转基因株系间以及转基因株系与野生型植株间进行杂交,分别对不同世代植株的根尖、花粉中gfp基因的表达量进行测定.结果表明,不同转基因株系间的根尖、花粉的gfp基因在表达量上存在差异,同一转基因材料的gfp基因表达存在组织差异;gfp基因在杂交后代中作为一个显性基因以孟德尔方式稳定遗传,不同染色体上的gfp基因重组有利于提高持基因表达.     

小鼠脂联素与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

以绿色荧光蛋白(GFP)基因(gfp)为报告基因,构建小鼠脂联素(mADPN)基因(mAd)与gfp的融合基因mAd/gfp表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd-gfp,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达可间接反映mADPN的表达,并通过RT-PCR在核酸水平进一步确证mAd的表达.荧光显微镜观察及RT-PCR结果均证明mADPN在COS-7细胞中获得了高效表达,表明mADPN重组表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd可以在真核细胞COS-7中高效表达mADPN,为进一步探讨mAd在小鼠体内的表达提供了可行性依据.