抗人CD19单链抗体基因的构建、表达及功能测定

采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出V_H和V_L可变区基因,再通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD19单链抗体（抗CD19-ScFv）基因。将其克隆至表达载体PET28a并在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,抗CD19-ScFv在BL21（DE3）菌中获得表达,重组蛋白的相对分子量为27kD,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实抗CD19ScFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD19结合,保留了鼠源性单抗与CD19结合活性。抗人CD19-ScFv的构建与表达,为下一步针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。     

抗松材线虫纤维素酶单链抗体库的构建及筛选

构建鼠源性松材线虫纤维素酶（Bursaphelenchus xylophilus cellulase, BXC）的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALB/C小鼠,从脾脏提取总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链（V_H）和轻链(V_L)可变区基因。经重叠PCR(SOE-PCR)在体外将V_H和V_L连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,成功构建了库容为5×10⁴的Anti-BXC单链抗体库,并从该抗体库中初步筛选到了特异性识别BXC的噬菌体单链抗体scFv。将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌HB2151进行可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,可溶性scFv获得表达,且与BXC具有结合活性,为松材线虫的检验检疫以及病理学研究奠定了基础。     

抗CEA单链抗体与链亲和素融合基因的表达

克隆分泌CEA杂交瘤细胞重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）,以Linker连接V_H及V_L构建抗CEA单链抗体.同时以Spacer连接单链抗体和链亲和素,构建成功单链抗体和链亲和素融合基因,克隆该融合基因至原核表达载体,pET21a(+),经IPTG诱导表达出该双特异性融合蛋白.活性鉴定表明该融合蛋白具有结合CEA及生物素的双特异性.该融合蛋白在生物领域中有较广阔的应用前景.     

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD20单链抗体（ScFv）表达载体上扩增抗CD20抗体轻链可变区基因（V^L）、重链可变区基因（V^H）,同时在抗体的可变区引入突变,然后将V^H、V^L基因重组到Fab′表达载体pYZF1中,构建抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体,并在大肠杆菌16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区,即G77→A（Ser→Asn）。突变的抗体的表达量为每克干菌3.8 mg,而未突变抗体的表达量为每克干菌1.3 mg。突变体的亲和力常数K_a为2.2×10⁹ L/mol,约为突变前的2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD20抗体HI₄₇和CD20表达细胞Raji细胞的结合,使HI₄₇的结合阳性率由98%下降至37.55%,体外细胞生长抑制试验亦证明突变的Fab′片段的抑制活性明显高于未突变的抗体。     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}     

抗人CD3单链抗体与改形单域抗体的表达

设计并化学合成含有适当酶切位点及连接肽的寡核苷酸序列,与一定的背景载体连接并改造成适用于单链抗体表达的载体:外分泌型pWAI80和融合蛋白型pROH80从分泌抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞UCHT1中,经PCR扩增出轻、重链可变区基因V_H和V_K,并插入上述表达载体中构建成单链抗体基因.通过对鼠OKT3结合位点的结构模拟,并比较人、鼠抗体家族性保守序列,设计出改形OKT3的基因序列.化学法部分合成8个寡核苷酸片段,应用重叠PCR技术扩增出完整改形重链基因V_H,并克隆、酶切和测序鉴定.将所克隆V_H基因插入表达载体pCOMB3和 pGEX-4T-1中进行表达.经 IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和 Western blot分析以及 ELISA检测,结果发现分泌型表达产物及 M13基因Ⅲ-V_H改形单域抗体融合蛋白具有与CD3单抗竞争抑制的活性;而融合型单链抗体及改形单域抗体表达产物主要以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的 30％左右.     

乙型肝炎病毒pre-S1区中和抗体可变区的原核表达

鼠源单克隆抗体MA18/7是特异识别乙型肝炎病毒 (HBV)pre S1抗原的中和抗体。为表达MA18/7的小分子抗体 ,将MA18/7的重链可变区基因(V_H)和轻链可变区(V_L)基因分别克隆到原核表达载体pTO-T7进行原核表达。结果V_H和V_L均以包涵体的形式高效表达 ,包涵体经过变性、复性及金属离子亲和纯化后获得纯度>90%的重组抗体片段。生物传感器、竞争ELISA和间接ELISA测定均显示 ,V_H 或V_L 均不能结合相应抗原 ,但二者体外混合后可迅速非共价结合形成具有良好活性的可变区抗体Fv,表明MA18/7的抗原结合活性区由重链可变区和轻链可变区共同组成.     

全人源化抗结肠癌单链抗体基因的克隆和表达

分离大肠癌患者外周血单个核细胞 (PBMC) ,在体外用灭活的大肠癌细胞再次致敏后 ,经EBV转化 ,然后用有限稀释法克隆分泌抗大肠癌细胞抗体的B细胞 ;多次PCR扩增和克隆其抗体可变区基因 (V_H/V_LcDNA) ,并用编码 (Gly₄Ser)₃ 的互补序列连接成ScFvcDNA(V_H linker V_L) ,经酶切克隆入载体fUSE 5RF ,使之呈现于噬菌体表面。通过用 3轮肿瘤细胞和正常人PBMC淘选后 ,ELISA检测 80%的单克隆噬菌体抗体显示了很强的阳性反应。以上结果初步说明 :联合应用体外致敏、EBV转化、PCR扩增和噬菌体呈现技术制备高亲和力全人源化的抗肿瘤抗体是可行的.     

抗人黑色素瘤单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

应用RT-PCR技术从分泌抗人黑色素瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞HB8760中克隆了抗体轻、重链可变区基因,用(Gly₄Ser)₃连接肽基因将V_H、V_L连接成ScFv基因,并进行了序列测定。ScFv基因全长927bp,其中VH基因长360bp,编码120个氨基酸,V_L基因长324bp,编码108个氨基酸。在大肠杆菌融合表达载体pGEX-4T-1中表达了GST-ScFv融合蛋白,表达产量占菌体总蛋白的29%。凝血酶消化后的产物具有黑色素瘤细胞结合活性。     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株S184中克隆了2.3 kb大小的vip3A基因并进行了序列分析。将vip3AS184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89 kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19%是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、斜纹夜蛾(S.litura)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3AS184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体（ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV－E2－ScFv。以重组的HCV E2蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选含有HCV－E2－ScFv基因的噬菌体克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经Ncol/NotⅠ酶切鉴定后,该ScFv基因由750bp组成,将菜亚克隆到pCANTAB5E载体中,转化大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCV E2单链可变区抗体的表达。酶联免疫吸附法（ELISA）证实表达的HCV－E2－ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,证实表达的HCV－E2－ScFv的分子量为28KD,为应用HCV－E2－ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。     

卵巢癌抗独特型单链抗体3D_5ScFv的高效表达

对 3D5卵巢癌抗独特型单链抗体进行原核系统的高效表达 .采用DNA重组技术 ,将 3D5ScFv克隆到原核表达载体pTMF中 ,重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;IPTG诱导表达 ,SDS PAGE鉴定蛋白质的分子量约为 2 8kD ;通过直接ELISA、竞争抑制实验和Western印迹分别检测其活性 .3D5ScFv以包涵体的形式获得高效表达 ,占菌体总蛋白 36 % ,变性复性后蛋白的纯度大于 90 % ,表达蛋白能与卵巢癌抗体OC12 5特异性结合 ,并能有效抑制卵巢癌抗原CA 12 5与卵巢癌抗体OC 12 5的特异性的结合 .3D5ScFv在原核系统中获得了高效表达 ,并具有较好的活性 ,为抗独特型抗体的人源化改造提供必要的元件     

人乳头瘤病毒16型湖北株E7基因的克隆和高效表达

利用基因克隆技术,将ＨＰＶ１６湖北株完整的Ｅ７基因克隆到含乳糖操纵子的表达载体ｐＷＲ５９０１上,经限制性酶切分析获得重组质粒ｐＷＨＢＥ７。ｐＷＨＢＥ７转化大肠杆菌后表达产生分子量为７０ｋＤ的融合蛋白ｌａｃＥ７,该蛋白在免疫印迹实验中可被标准Ｅ７单抗识别。经ＩＰＴＧ诱导后,Ｅ７融合蛋白产量可达细菌总蛋白含量的３０％以上。利用ｌａｃＥ７蛋白在细菌胞浆中形成包含体的性质,简便地提取并纯化了该蛋白质。结果为从免疫学角度探讨ＨＰＶ１６与宫颈癌的关系以及ＨＰＶ疫苗的研制打下基础。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆和表达

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出抗体V_H 和V_L 基因 ,连接成ScFv基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中构建了重组质粒pXScFv 2E3。经序列分析证实 ,V_H 和V_L 基因及linker基因拼接正确 ,基因全长为 726bp ,编码 242个氨基酸。随后将其定向克隆于表达载体pHOG21,转化至大肠杆菌XL1 BLUE筛选出表达菌株XL1 BLUE(pHOG 2E3)。经ELISA和SDS PAGE分析表明 ,在20℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 25 %。并且ScFv基因表达产物能够中和α毒素的磷酯酶C活性     

Preparation and characterization of recombinant protein ScFv(CD11c)-TRP2 for tumor therapy from inclusion bodies in Escherichia coli

Dendritic cells (DCs)-based immunotherapy represents an approach to the prevention and treatment of cancers. Targeting antigens to receptors on DCs can be expected to enhance immune response. We have constructed an expression vector pET32a(+)-ScFv(CD11c)-TRP2 based on a single-chain antibody fragment (ScFv) that targets the high affinity receptor CD11c which is expressed on murine DCs. The 3'-terminal end of the ScFv was ligated to the gene for MHC class I molecule-recognized peptide from mouse tyrosine-related protein 2 (TRP2). Using this vector, we have expressed and purified ScFv(CD11c)-TRP2, a fusion protein that could target TRP2 peptide to CD11c on DCs in vivo to elicit anti-tumor responses. This fusion protein was expressed in inclusion bodies in Escherichia coli BL21(DE3) and was refolded and purified on-column effectively by immobilized metal affinity chromatography using His-tag. Flow cytometry assays showed the specific binding ability of ScFv(CD11c)-TRP2 to DCs, which could be blocked by a hamster anti-mouse CD11c produced by N418 hybridoma. Further studies demonstrated that ScFv(CD11c)-targeted TRP2 peptide processed by DCs was capable of stimulating T cells proliferation. Thus, this fusion protein provides a basis for further research in cancer therapy in vivo.     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

Ⅱ型志贺毒素单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的表达和功能鉴定

目的从分泌抗肠出血性大肠埃希菌Ⅱ型志贺毒素中和单克隆抗体杂交瘤细胞株S2C4中克隆抗体可变区基因,构建单链抗体（ScFv）,进行原核表达,并对其功能进行鉴定。方法从杂交瘤细胞株S2C4中提取总RNA,逆转录成cDNA。在cDNA3’-OH末端添加poly．G。PCR扩增包括5’非翻译区和信号肽序列在内的抗体重、轻链可变区基因VH和VL,PCR产物装入T—A载体测序。根据测序结果,设计引物分别扩增VH和VL编码区,再通过重叠PCR,在VH和VL．编码区基因之间引入连接链,构建Scn基因,并克隆到表达载体pComb3xSS中。重组载体导入E．coliTop10F’进行表达,重组蛋白经纯化后,分别用ELISA和动物保护性实验鉴定其生物学活性。结果VH和VL编码区基因全长分别为396bp和378bp,ScFv基因能在大肠埃希菌中高效表达,表达产物的分子量为34000,用NiSO4亲和层析柱成功纯化。功能性实验表明纯化的重组蛋白可以与Stx2毒素有效结合,能保护动物抵御毒素分子的攻击。结论成功地克隆S2C4单抗可变区基因,并构建、表达其单链抗体ScFv,为下一步进行该抗体人源化奠定实验基础。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白的克隆及表达

采用PCR技术从宫颈癌组织中扩增人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type16,HPV16)L1全长基因片段,目的片段克隆到pMD18T载体后经酶切鉴定及测序确认。构建重组原核表达质粒pGEX4T1-L1,转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导表达出以非可溶性蛋白形式存在的表达蛋白,该重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的17%,免疫印迹检测表明,表达蛋白与宫颈癌病人血清出现特异性反应。成功构建了重组原核表达质粒pGEX4T1-L1,并且在原核细胞中得到表达,为进一步研究L1蛋白的免疫学活性及疫苗的研发奠定了基础。     

冠状病毒HcoV-229E S1蛋白的原核表达及鉴定

目的克隆表达冠状病毒HcoV-229E S1基因片段,表达S1蛋白。方法合成冠状病毒HcoV-229ES1蛋白特异性基因片段并克隆入pET21a原核表达载体,转化BL21（DE3）菌,经IPTG高效诱导表达得到重组蛋白,用金属螯合亲和层析纯化,并通过Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果获得了主要以包涵体形式存在的目的蛋白,Western blot鉴定其为S1基因片段蛋白。结论成功构建了HcoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,为下一步表达蛋白免疫原性及疫苗抗病毒保护性测定打下了基础。