NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

转修饰cry1Ac基因籼稻明恢81经花药培养获得抗虫DH系

对基因枪法获得的明恢81转修饰的cry1Ac基因当代植株进行花药培养,共接种花药2600枚,获得83份花培植株,其中双倍体植株43份,单倍体植株40份。 PCR结果表明含有cry1Ac基因的植株55份,花培植株群体中转基因与非转基因植株的比值为2∶1（55/28）。进一步结合Southern blot和ELISA分析,于花培植株当代筛选到转基因纯合株系36份。外源蛋白表达量上,花药来源于同一克隆的DH系的不同植株之间基本一致,最高的Cry1Ac含量达0.25%。田间抗虫性试验表明,经花药培养纯合获得的部分转基因纯合系植株对二化螟(Chilo suppressalis)表现出高抗,而且主要农艺性状保持不变。以上结果表明水稻花药培养可以加速转基因的纯合与育种利用。     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T₀代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T₁代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

水稻小穗分化调控基因fzp(t)的遗传分析和分子标记定位

从V20B/花1B杂交后代中发现了水稻小穗分化受阻的突变体fzp. fzp株叶形态正常, 但植株分蘖数明显减少, 最显著的变异是fzp植株的小穗分化完全被阻断, 在正常植株枝梗分化为小穗的部位, fzp植株却形成一团枝梗. 遗传分析表明,fzp受一对隐性基因控制, 其相应基因拟名为fzp(t). 显然fzp(t)是控制小穗分化的关键基因. 在一些F2群体中, 因遗传背景发生改变, 部分突变型植株表现为“中间类型”, 推测可能是冗余基因或其他修饰基因、互作基因的作用. 采用微卫星标记技术和BSA分析方法, 将突变基因fzp(t)定位于第7染色体上的长臂末端, 其中RM172和RM248位于fzp(t)一侧, 它们与fzp(t)的遗传图距分别为3.3和6.4 cM; RM18和RM234位于fzp(t)的另一侧, 与fzp(t)的遗传距离分别为23.1和25.3 cM. 研究结果为进一步对该基因的克隆和功能研究奠定了基础.     

哺乳动物Bax基因在长春花细胞中的诱导表达及其对长春花生物碱合成的促进作用

Bax是哺乳动物细胞凋亡基因Bcl-2家族中的一员. 以往的研究报道表明, Bax基因可以诱发拟南芥等模式植物的超敏反应 (hypersensitive reactions, HR). 为了考查Bax基因对药用植物细胞次生代谢产物合成的影响, 我们构建了长春花雌二醇诱导型Bax基因工程细胞系. 实验结果表明, 转基因长春花细胞中Bax基因的表达水平对β-雌二醇浓度呈现明显的依赖性, 说明雌二醇诱导型启动子可以有效控制转基因长春花细胞中Bax基因的表达. 在30 μmol/L β-雌二醇处理下, 转基因长春花细胞中的长春花碱和总生物碱含量分别比野生型细胞高5. 0和5. 5倍, 表明哺乳动物Bax基因对长春花细胞中生物碱的合成具有促进作用. Northern blotting和Western blotting检测结果表明, Bax基因可以提高转基因长春花细胞中萜类吲哚碱生物合成途径关键酶基因Tdc和Str的转录水平, 并且促进细胞中防御相关蛋白PR1的积累, 说明Bax基因可以诱发长春花细胞的防御反应, 激活细胞中萜类吲哚碱生物合成途径, 从而提高长春花生物碱的合成代谢流量. 研究结果表明, 哺乳动物Bax基因可以从细胞水平上促进植物次生产物的合成, 为植物细胞次生代谢产物合成的分子调控提供了一种新的策略.     

大车前体外再生体系的建立和优化

大车前不仅有很高的药用价值,在生态学研究方面也是重要模式植物。关于大车前的组培,目前报道很少。我们通过不定芽直接再生和愈伤组织诱导两种途径,建立了大车前（Plantago major L. ‘Giant Turkish.’）的快速高效组培再生系统。完整的成熟种子培养在添加IAA和TDZ的MS培养基中,不经过愈伤的分化阶段,从子叶节的部位产生不定芽,直接不定芽的诱导频率达到100%。在0.2mg/L IAA和1.0mg/L TDZ作用下,培养4～5周后平均每个外植体产生再生芽的数目达到14.6个。对同一个外植体诱导得到的9株再生植株进行的RAPD检测表明,部分植株在DNA水平上发生了变异。以叶片作为外植体,在添加1.0mg/L NAA的MS固体培养基中培养3周后,伤口处形成愈伤组织,产生愈伤的频率平均为98%。愈伤组织在添加4.0mg/L 6BA的MS固体培养基中分化得到再生芽,分化频率为25%,平均每块愈伤产生再生芽2.8个。两种途径得到的再生芽转到1/2 MS培养基上均可生根、长成完整植株,小苗移栽到温室90%能够存活。     

水稻单拷贝Xa21近等转基因系的培育与抗性分析

植物转基因的表达在一定程度上受其所在宿主基因组整合位置的影响 ,通常称为转基因位置效应。利用农杆菌介导法将抗白叶枯病基因Xa21转入水稻品种明恢 63,获得带有不同转基因拷贝数的转化体。对转化体连续自交 ,并对转基因整合位点进行鉴定和筛选 ,获得了明恢63遗传背景下整合在不同染色体位点的单拷贝Xa21转基因纯合系。这些转基因系除一个单拷贝转基因整合位点外 ,在基因组水平上是等同的 ,构成了近等转基因系。经分子杂交和遗传定位验证 ,共获得明恢63遗传背景下的6个近等转基因系。对这些近等转基因系进行抗白叶枯病分析,显示出几乎相同的高抗水平。这表明整合位点对Xa21的抗性没有影响 ,不存在转基因位置效应.     

p53对restin基因转录表达的调控作用

restin基因是Zhu等人从全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导肿瘤细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤抗原相关基因. 前期研究表明, 该基因与细胞周期阻滞有关. 由于p53在细胞增殖调控中占据重要地位, 并且与维甲酸具有诱导关系, 因此本研究试图揭示维甲酸诱导restin基因表达是否与p53有关. 将p53转染真核细胞, 研究restin与p53的表达关系. 结果表明p53能诱导restin基因转录增加. 进一步分析发现, restin基因5¢端上游约2 kb基因组序列中存在p53蛋白结合位点. 扩增该序列构建荧光报告系统, 检测到该报告系统可以接受维甲酸的诱导调控. 在此基础上, 研究p53对缺失p53结合位点的截短体报告质粒和p53结合位点突变后的报告质粒的作用, 结果显示p53调控restin基因的表达与该基因上游序列区中的p53结合位点无关, 推测p53对restin基因的表达调控可能还存在其他分子的相互作用.