伪狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原区在巴斯德毕赤酵母中的表达

伪狂犬病病毒gE蛋白是一种重要的诊断抗原,可用于伪狂犬病根除计划中的鉴别诊断。为了获得大量的抗原,将编码gE主要抗原区域的基因片段插入毕赤酵母表达载体中,得到的重组表达载体转化GS115酵母,通过G418抗性筛选得到一株多拷贝的重组酵母,经甲醇诱导表达了截短的gE蛋白,并分泌到胞外。Western blotting分析显示表达的蛋白大小为33kD。ELISA结果表明表达蛋白具有良好的抗原性,重组酵母的诱导培养上清不需纯化可直接作为抗原检测gE的抗体,这为研制质优价廉的鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达与gE乳胶凝集鉴别诊断方法的建立

将伪狂犬病病毒(PRV)Ea株gE基因主要抗原表位区段融合到原核表达载体pET28b的T7启动子下游,构建成原核表达质粒,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot印迹分析,证实gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达,表达产物具有抗原性,分子量为38kD,位于包涵体中.包涵体经变性、复性处理,复性产物致敏乳胶,并对抗原致敏浓度、致敏时间、致敏温度进行优化,建立了gE乳胶凝集试验(gE-LAT).该方法不仅能显著区分gE基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清,而且具有简便、快速等优点.检测临床360份猪血清,阳性率为57.78%(208/360),比国外阻断gE-ELISA的58.06%(209/360)略低,阳性符合率为94.86%(203/214),总符合率为96.94%(349/360),两种检测方法结果差异不显著(P＞0.05).     

猪伪狂犬病毒gB基因在大肠杆菌中的分段表达

目的分段表达伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）gB基因,用于PRV疫苗免疫抗体评估试剂盒研究。方法分析gB抗原表位,设计4对特异性引物,从PRV新疆分离株中扩增gB基因的4个片段,分别命名为gB-1、gB-3、gB-4和gB-5基因,克隆到pGEM-T-easy载体并测序。再将4个gB基因片段融合到pGEX-6P-1原核表达载体中,表达并纯化。Western Blotting进行重组蛋白的抗原性检测。以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,检测猪血清临床样品。结果构建的4种表达质粒均可在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,表达分子量分别为75.05、53.86、49.96和49.72×10^3Da,其中gB-3、gB-4和gB-5表达量较高,表达产物主要存在于包涵体中。Western Bloting鉴定显示,4种融合蛋白均可被猪伪狂犬阳性血清特异识别。以gB-3、gB-4和gB-5建立的ELISA方法与IDEXX公司的gB-ELISA试剂盒符合率分别为40.9%、81.8%和81.8%。结论本研究成功表达了PRV的gB-1、gB-3、gB-4和gB-5重组蛋白,gB-3、gB-4和gB-5表达量较高;其中以gB-4和gB-5建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的符合率较高。     

基因重组戊肝病毒多价复合抗原的表达及初步应用

目的：利用基因工程技术体外表达高效HEV多价复合抗原,建立一套敏感和特异的抗HEV检测体系,方法：将前期构建的基因重组戊肝病毒多价复合抗原表达质粒转化大肠埃希菌JM109。筛选鉴定阳性克隆并进行诱导表达,表达产物经分子筛层析纯化后,利用western blot作抗原特异性鉴定,以此抗原建立ELISA检测卫生部生物药品检定所HEV血清参比品及临床血清标本,同时以Genelab公司抗HEVELISA试剂盒作为对照进行对比研究。结果：重组质粒转化大肠埃希菌JM109株后的阳性克隆,经诱导在SDS-PAGE中出现一条分子量大小约为31.5kD的蛋白条带,该蛋白纯化后经Western Blotting检测证实为HEV特异性抗原,以此抗原包被酶联板建立ELISA检测53份国家卫生部标准HEV参比血清,灵敏度达100%（38/38）,特异度达93.3%(14/15)。用此方法检测68份临床标本,并与Gene4labELISA试剂盒结果比较,两者阴阳性相符的有64份,总符合率为94.1%。结论：本实验克隆表达的基因重组戊肝病毒多价复合抗原具有良好抗原性,以此抗原建立的抗HEVELISA具有灵敏度高,特异性强的特点,可望为戊型肝炎的血清学诊断和流行病学调查提供一种更为有效的检测手段。     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及缺失转移载体的构建

根据已发表的伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)的 gI和 gE 基因序列 ,设计两对引物用PCR方法扩增出PRV SH gI和 gE 基因 ,将其克隆入 pUC18载体中 ,获得了缺失部分gI基因的转移载体质粒 ,命名为 pgEI。     

狂犬病病毒N蛋白主要抗原区的表达及SPA-ELISA抗体检测方法的建立

为有效监测免疫狂犬病疫苗后的抗体水平,以狂犬病病毒N蛋白的主要抗原表位所在区域N1蛋白为包被抗原,建立了SPA-ELISA抗体检测方法。用RT-PCR方法分别扩增出狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1区域 (1 000~1 353 bp),将二者分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,并将重组的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3) 中,经1 mmol/L IPTG诱导后进行免疫印迹分析。结果表明,重组的RV N和RV N1均以包涵体形式表达。与表达全长RV N相比,RV N1的表达量显著高于前者,且该重组蛋白同样具有良好的反应原性。用纯化的重组RV N1作为诊断抗原建立了检测犬RV抗体的间接ELISA方法。通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量是2 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,Protein A-HRP的稀释度为1∶4 000。用建立的ELISA方法对102份临床血清样品进行检测,与商品化试剂盒相比,二者的符合率为94.1％。试验结果表明基于主要抗原表位所在区域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗体水平的检测,为检测RV免疫抗体的ELISA试剂盒的研制奠定了基础。     

水泡性口炎病毒核蛋白基因的表达及初步应用

将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建N基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,经PCR限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得N基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了水泡性口炎病毒N基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达N蛋白抗原。SDS-PAGE、Western blotting及间接ELISA试验结果表明,表达蛋白为融合蛋白,质量约63.5 kD,其表达产量约占菌体总蛋白的16％,相当于92mg/L。融合蛋白中含有水泡性口炎病毒群特异性的核蛋白抗原,应用表达的VSV核蛋白抗原建立了酶联免疫吸附试验,通过对186份山羊、豚鼠实验动物人工感染VSV的血清样品和参考血清样品的检测,并与微量血清中和试验进行了比较,结果表明：以表达的VSV核蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验是一种特异性强、敏感性高、快速、简单、安全的检测方法,抗原制备成本低。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立

将已获得的含猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域编码基因VP2I重组酵母菌株在优化的条件下进行诱导表达,表达产物蛋白含量达227.6μg/ml,在此基础上以重组蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,结果表明抗原最佳包被浓度5.69μg/ml,而血清最佳稀释倍数为1∶80.阳性标准初步定为:OD待测样品＞0.5,且OD待测样品/OD阴性血清＞2.0.采用iVP2I-ELISA对猪血清样品进行检测,结果显示iVP2I-ELISA与HI试验的符合率为97.2%,与国外同类试剂盒的符合率达到91.2%.     

猪伪狂犬病综合诊断及分离毒株gE和TK基因遗传变异分析

2012年以来,许多使用gE基因缺失活疫苗免疫过的猪场广泛性出现伪狂犬病毒(PRV)感染,gE抗体阳性率不断升高,伪狂犬典型病例不断增加。2018年3月鲁南地区几个种猪场先后发生疑似伪狂犬病疫情,怀孕母猪流产、产死胎和木乃伊胎,仔猪出现神经症状且死亡率高。通过对病死猪及死胚剖检进行初步诊断,取病料进一步进行病理组织学诊断及病毒分离鉴定。结果显示,病死猪均可见病毒性脑炎、肝细胞变性坏死及淋巴组织坏死等病理变化,在病变的神经元、肝细胞、扁桃体隐窝上皮细胞等细胞核内见红染包涵体。对分离到的4株PRV进行了gE和TK基因的序列测定及遗传变异分析发现,4株PRV的gE和TK核苷酸序列的同源性分别为98.8%~99.3%和98.9%~99.6%,与国内流行毒株其核苷酸序列的同源性分别99.1%~99.7%和98.6%~99.8%,与匈牙利和美国等流行毒株核苷酸序列的同源性分别为97.3%~97.8%和98.8%~99.5%,表明4株分离株高度同源,与国内PRV变异株处在同一分支,而与匈牙利和美国等毒株遗传距离较远。传统疫苗对PRV变异毒株不能提供有效保护,给猪场伪狂犬病的防控和净化工作带来了新的挑战。     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

伪狂犬病毒gE基因在昆虫细胞中的高效表达

In order to develop a simple and safe test for the detection of vaccinated as well as wild type Pseudorabies virus (PRV) infected pigs, the modified gE gene of PRV Ea strain, obtained by cutting the 5' UTR using PCR and DNA recombinant technique, was inserted into baculovirus expression vector pFastBac 1, resulting the trans-position plamid pFE1.75. After homologous recombination, recombinant baculovirus rvBacE1.75 was gained and high level expression of glycoprotein E (gE) was observed after the infection of rvBacE1.75 to Tn-5B1-4 cells. The expression product was 80-88 kD and was specific to antisera against PRV Ea strain by Western-blotting. Purified recombinant proteins were used as an antigen in Latex Agglutination Test(gE-LAT) and the test was specific, sensitive, safe and simple.     

棉铃虫组织蛋白酶B多克隆抗体制备及鉴定

介绍了用重组的棉铃虫组织蛋白酶B(HCB)制备兔多克隆抗体的方法。用已经克隆得到的pGEX 4T 1 HCB重组质粒转化的大肠杆菌 (Escherichiacoli)BL2 1菌株进行诱导表达 ,获得融合表达的包涵体产物。经过变性、复性等方法处理包涵体 ,获得可溶性融合蛋白。用凝血酶裂解融合蛋白 ,再经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化目的蛋白HCB ,用做抗原免疫家兔。产生的抗血清经硫酸铵沉淀 ,最后得到了抗棉铃虫组织蛋白酶B的多克隆抗体。用间接酶联免疫吸附测定法测得该抗体对重组表达的组织蛋白酶B和棉铃虫体内的组织蛋白酶B的效价分别为 1∶5 1 2 0 0和 1∶2 5 60 0。通过免疫印迹检测证明此抗体不仅可以识别重组表达的棉铃虫组织蛋白B ,而且可以识别棉铃虫卵巢匀浆液中的棉铃虫组织蛋白酶B。     

共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性

【目的】研制猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二联活疫苗,并用猪IL-18作为免疫佐剂。【方法】将猪IL-18基因插入到质粒p GO中,获得的重组转移质粒p GO18与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染ST细胞,并进行空斑筛选和纯化;RT-PCR和Western blot分别从转录和蛋白水平鉴定其表达情况。将重组病毒PGO18和PGO、PRV弱毒株HB98、PCV2灭活商品苗和1640细胞培养基分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后二次免疫,二免后4周用PCV2 DF强毒和PRV Min/A强毒接种小鼠。通过ELISA、血清中和试验和流式细胞术及攻毒保护试验评价重组病毒的免疫原性。【结果】获得了重组病毒PGO18,并且可在ST细胞内表达;PGO18可诱导小鼠机体产生PCV2的ELISA和PRV的中和抗体水平,刺激CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的增殖,且能有效抵抗PCV2和PRV强毒攻击。【结论】IL-18基因可增强重组病毒的免疫效果,使重组病毒具有良好的免疫原性,有望成为防治PCV2和PRV的候选疫苗株。     

HIV-1型核衣壳蛋白P24截短体在大肠杆菌中的表达,纯化和鉴定

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ １ｇａｇ基因中扩增出衣壳蛋白Ｐ２４截短体（ｔＰ２４）基因,插入质粒ｐＧＥＸ ４Ｔ３中构成重组表达质粒ｐＧＥＸ ｔｐ２４,将ｐＧＥＸ ｔｐ２４转化大肠杆菌ＢＬ２１后获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白量的３４３８％。经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化的截短体Ｐ２４纯度为９２７７％。纯化的截短体Ｐ２４在间接ＥＬＩＳＡ和免疫印迹检测ＨＩＶ抗体阳性血清和正常人血清中,具有很高的抗原特异性和免疫反应性。     

Construction and immunogenicity of recombinant pseudorabies virus expressing the modified GP5m protein of porcine reproduction and respiratory syndrome virus

Pseudorabies virus (PRV),an alpha-herpesvirus,has been developed as a live viral vector for animal vaccines.However,the PRV recombinant virus TK-/gE-/GP5+expressing GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),based on the PRV genetically depleted vaccine strain TK-/gE-/LacZ+,scarcely stimulated the vaccinated animals to produce neutralizing antibodies against PRRSV.To develop a booster-specific immune response of such PRV recombinants,the ORF5m gene (the modified ORF5 gene having better immune responses)was substituted for the ORF5 gene and introduced into PRV TK-/gE-/LacZ+,resulting in a PRV recombinant named TK-/gE-/GPSm+,which expressed the modified GPSm protein.The recombinant virus was confirmed using PCR,Southern blotting and Western blotting.TK-/gE-/GPSm+and TK-/gE-/GP5+expressing the authentic GP5 protein were inoculated into Balb/c mice to evaluate their immune responses.The results indicated that the protecting neutralization antibodies (the 3/6 vaccinated mice obtained 1:16)and cell immune responses induced by TK-/gE-/GPSm+against PRRSV were higher than that induced by TK-/gE-/GP5+.Thus,the development of the new PRV recombinant expressing the modified GP5m protein as a candidate vaccine established the basis for the study of bivalent genetic engineering vaccines against PRRSV and PRV.     

A recombinant pseudorabies virus co-expressing capsid proteins precursor P1-2A of FMDV and VP2 protein of porcine parvovirus: a trivalent vaccine candidate

Pseudorabies (PR), foot-and-mouth disease (FMD), and porcine parvovirus disease are three important infectious diseases in swine worldwide. The gene-deleted pseudorabies virus (PRV) has been used as a live-viral vector to develop multivalent genetic engineering vaccine. In this study, a recombinant PRV, which could co-express protein precursor P1-2A of FMDV and VP2 protein of PPV, was constructed using PRV TK⁻/gE⁻/LacZ⁺ mutant as the vector. After homologous recombination and plaque purification, recombinant virus PRV TK⁻/gE⁻/P1-2A-VP2 was acquired and identified. Immunogenicity, safety of the recombinant PRV and its protection against PRV were confirmed in a mouse model by indirect ELISA and serum neutralization test. The results show that the recombinant PRV is a candidate vaccine strain to develop a novel trivalent vaccine against PRV, FMDV and PPV in swine.     

旋毛虫肌幼虫ES抗原的基因克隆及高效表达

作者对编码旋毛虫肌幼虫ES抗原的部分结构基因进行了克隆、鉴定和表达。用RNA PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫总RNA中反转录并扩增出0．7kh的靶DNA,酶切分析后将其克隆到融合表达载体pEx3lC中。SDS—PAGE电泳表明,含重组子的大肠杆菌能够表达出一分子量为37kDa的融合蛋白(P37),后者占菌体总蛋白的22%以上,并以包含体形式存在于菌体中。经对纯化后表达蛋白的ELlSA检测,证明它能被猪旋毛虫病阳性血清和抗旋毛虫单克隆抗体识别。研究结果揭示,重组蛋白P37对于研制旋毛虫病诊断抗原和免疫抗原具有潜在的应用价值。     

Immune potential of a novel multiple-epitope vaccine to FMDV type Asia 1 in guinea pigs and sheep

To develop a safe and efficient recombinant subunit vaccine to foot-and-mouth disease virus(FMDV)type Asia 1 in sheep,a tandem repeated multiple-epitope gene consisting of residues 137-160 and 197-211 of the VP1 gene of FMDV was designed and artificially synthesized.The biologically functional molecule,the ovine IgG heavy constant region(oIgG)as a protein carrier was introduced for design of the multiple-epitope recombinant vaccine and recombinant expression plasmids pET-30a-RE and pET-30a-RE-oIgG were successfully constructed.The recombinant proteins,RE and RE-oIgG,were expressed as a formation of inclusion bodies in E.coli.The immune potential of this vaccine regime in guinea pigs and sheep was evaluated.The results showed that IgG could significantly enhance the immune potential of antigenic epitopes.The recombinant protein RE-oIgG could not only elicit the high levels of neutralizing antibodies and lymphocytes proliferation responses in the vaccinated guinea pigs,but confer complete protection in guinea pigs against virus challenge.Although the recombinant protein RE could not confer protection in the vaccinated animals,it could delay the appearance of the clinical signs and reduce the severity of disease.Inspiringly,the titers of anti-FMDV neutralizing antibodies elicited in sheep vaccinated with RE-oIgG was significantly higher than that for the RE vaccination.Therefore,we speculated that this vaccine formulation may be a promising strategy for designing a novel vaccine against FMDV in the future.