棉铃虫田间种群Bt毒素Cry1Ac抗性基因频率的估算

采用改进的F₁筛查法检测了2005年采自华北地区的棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)田间种群对Bt毒素Cry1Ac的抗性基因频率。2005年从河南安阳和河北沧县转Bt基因抗虫棉上采集二代棉铃虫卵,在室内用人工饲料饲养至2龄幼虫,用1 μg/cm² 的Cry1Ac活化毒素进行初筛,将初筛存活成虫与室内筛选的GYBT抗性品系成虫进行单对杂交,并用区分剂量(2.5 μg/cm²)对F₁代进行检测。经检测,2005年河南安阳棉铃虫种群和河北沧县棉铃虫种群对Cry1Ac抗性基因频率基本一致,分别为1.4×10^-3和1.5×10^-3。用毒素涂表法测定了2004、2005年采自河南安阳、河北高阳、河北沧县、新疆阿克苏和新疆沙湾棉铃虫田间种群对Cry1Ac活化毒素的敏感性水平,结果表明华北棉区与新疆内陆棉区棉铃虫种群对Cry1Ac的敏感性存在一定的地区性差异（<8倍）。总体上,我国华北棉区棉铃虫种群对Cry1Ac还未产生明显抗性,抗性基因频率处于正常水平。棉铃虫对转Bt基因抗虫棉的抗性风险依然存在,需要尽快启动全国性的早期抗性检测和预警工作。     

盐城棉区棉铃虫田间种群对Bt蛋白的抗性基因频率

【背景】转Bt基因抗虫棉已经在我国进行了近20年的大规模商业化种植,产生了显著的经济和环境效益。但是,靶标害虫棉铃虫的抗性是转Bt基因抗虫棉产业健康发展所面临的最大问题,而抗性监测是解决这一问题的必要管理措施。盐城市是江苏省转基因抗虫棉的主产区,但有关该地区棉铃虫对转Bt基因抗虫棉的抗性基因频率未见报道。【方法】于2012年在盐城三龙镇和东台镇棉区采集田间棉铃虫种群,检测了初孵幼虫对花铃期转Bt基因抗虫棉中30幼嫩叶片的敏感性,用区分剂量法检测了2龄幼虫对Bt蛋白的抗性基因频率。【结果】取食转Bt基因抗虫棉叶片后,棉铃虫初孵幼虫在9 d内全部死亡;三龙镇和东台镇棉铃虫2龄幼虫对Bt蛋白的抗性基因频率分别为7.6×10-3和6.9×10-3。【结论与意义】目前,盐城棉区的棉铃虫对转Bt基因抗虫棉仍保持很高的敏感性,棉铃虫种群对Bt蛋白的抗性基因频率没有发生显著变化,但仍需持续监测。     

F1代法监测田间棉铃虫对转Bt基因棉的抗性

采用表达单价Cry1Ac毒素的转Bt基因棉棉叶喂饲法比较了棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)抗、感亲本及正反交后代在Bt棉上5 d的发育速率,确定棉铃虫在Bt棉上5 d发育到2龄中期以上、体重≥0.6 mg的个体作为判别抗性纯合子的标准。2006年采用F₁代法在室内用Bt棉叶喂饲法检测河北省邱县Bt棉田棉铃虫对Bt棉的抗性等位基因频率。结果表明,127头田间雄虫中24头携带抗性基因,估测抗性等位基因频率为0.94（95%CI：0.044～0.145）,该值为在国内首次检测到的高抗性等位基因频率。该地区长期大面积种植转单价Bt棉和缺少非Bt棉作为有效庇护区导致田间抗性快速进化,需要尽快采取有效的抗性治理策略。本文还讨论了影响大田产生抗性的因素以及田间存在的抗性风险等。     

棉铃虫对转Bt基因棉的抗性筛选及遗传方式的研究

通过室内筛选获得了棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)对转Bt基因棉的抗性种群,并在此基础上进行了抗性遗传方式的研究。试验结果表明：经16代筛选,棉铃虫对转Bt基因棉的抗性倍数上升到43.3倍。筛选过程中,棉铃虫7日龄幼虫的体重和成虫羽化率变化明显,被选为确定筛选剂量的标准。敏感与抗性棉铃虫杂交,正交、反交的显性度都小于0、杂交过程中雌雄性比基本接近1∶1、假设抗性基因为单基因时的χ²值较低,因此,初步认为棉铃虫对转Bt基因棉的抗性是常染色体单基因控制的不完全隐性遗传。     

新疆棉区田间棉铃虫种群对Bt Cry1Ac毒蛋白的敏感性研究

为了明确新疆棉区棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)种群对Bt Cry1Ac毒蛋白的敏感性变化,本次研究采用单雌系F1/F2代诊断剂量法于2013-2019年连续监测了新疆库尔勒市棉铃虫种群对Cry1Ac毒蛋白的抗性频率以及种群敏感度的变化.结果表明,2013-2019年新疆库尔勒市棉铃虫种群...     

棉铃虫对转Bt基因棉的抗性及其治理策略研究进展棉铃虫对转Bt基因棉的抗性及其治理策略研究进展

简述了苏云金杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）毒素的作用方式及杀虫机理,分析了Bt棉种植过程中面临的生态风险。综述了昆虫对Bt毒素的抗性机理、监测方法及治理策略方面的研究进展。棉铃虫对Bt棉的抗性可能主要与中肠上皮细胞膜上的特异性结合受体中结合位点的改变有关。在多种抗性治理策略中,庇护所策略被公认为是目前最有效的并已广泛采用的抗性治理措施。应针对Bt棉在我国的种植情况,在棉铃虫还未在田间表现出抗性以前,制定合理的抗性预防、治理措施。     

小菜蛾对Bt毒素Cry1Ac和Bt制剂抗性的选育及其抗性种群的生物学适应性

用Bt制剂和Bt毒素Cry1Ac分别对源自深圳田间的小菜蛾Plutella xylostella在室内进行抗性种群选育,获得相对抗性倍数分别为24.36、38.16倍的抗性种群DBM.1Ac-R30和DBM.Bt-R46。对这2个抗性种群及其敏感种群（DBM.Bt-S）的生长发育、存活及繁殖特征进行了详细地观察与比较,并以甘蓝为饲喂材料构建了2个抗性实验种群的生命表。结果表明,DBM.1Ac-R30和DBM.Bt-R46种群较DBM.Bt-S种群的产卵量和孵化率下降,幼虫发育历期延长,雌雄比显著降低,雌成虫数量、寿命减少。DBM.1Ac-R30和DBM.Bt-R46种群相对于DBM.Bt-S种群的相对适合度分别为0.75和0.65,抗性种群在繁殖能力上存在明显的生存劣势。     

湖北棉区转Bt基因棉对棉铃虫的控制作用

2000-2001年通过田间系统调查,表明转Bt基因棉（品种为GK19）在湖北江汉平原棉区对棉铃虫抗性稳定。试验设3个处理：转Bt基因棉化防田（使用化学农药控制害虫）、转Bt基因棉自控田（依靠天敌控制害虫）及常规棉对照田（利用综合防治措施控制害虫）。从棉铃虫的第2代到第5代整个发生期内,即使在不进行化学防治的情况下,棉铃虫在Bt棉田的发生量也保持在极低的水平(最高百株虫量为12头)。室内饲养结果表明,转Bt基因棉对棉铃虫的生长发育（幼虫体重、蛹重）有较为明显的影响,使6龄幼虫体重减少25.6%,蛹重减少18.2%。棉铃虫幼虫取食转Bt基因棉组织后,发育迟缓,相对于常规棉喂养的整个发育历期延长17 d,使棉铃虫在田间的危害减少至少一个世代。另外,接虫试验表明,棉铃虫幼虫在常规棉上的取食时间是转Bt基因棉株上的6.1倍,极大地减轻了棉铃虫的危害程度。     

棉铃虫对Bt杀虫剂的抗性遗传方式

随着转基因棉花种植面积的日益增加,棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner)对Bt的抗性已经成为一个不容忽视的问题。发展转多价基因作物是当前缓解害虫对Bt抗性的最有效措施。本研究以经室内多年筛选的、抗性倍数达2 000多倍的Bt杀虫剂（含多种蛋白）抗性品系为材料,通过生物测定和不同的杂交试验,测定棉铃虫对Bt杀虫剂的抗性遗传方式,以期为Bt生物农药的抗性治理提供一定的依据,同时为制定棉铃虫对转多基因作物的抗性治理策略提供一定的参考。对敏感亲本和抗性亲本杂交产生的F1代的研究结果表明,杂交品系的抗性倍数分别为22.2倍和24.6倍;抗性显性度D值均小于0,分别为-0.20和-0.17,抗性为常染色体不完全隐性遗传。对4种回交后代和2种自交后代F2的研究结果表明,实际死亡率与期望死亡率差异较大,说明抗性是由单基因多个位点或多基因控制。     

棉铃虫取食转Bt棉后蛹的抗寒力测定

在棉铃虫HelicoverpaarmigeraH櫣bner人工饲料中分别添加转Bt基因棉叶粉和常规棉叶粉饲喂幼虫,经滞育诱导后,发现2个处理间棉铃虫蛹的滞育率相似,2个处理间滞育蛹的自由水和结合水含量没有差异;但取食含Bt棉叶粉人工饲料的棉铃虫滞育蛹的过冷却点和结冰点显著高于对照组,蛹重及与抗寒性有关的脂肪和糖原含量均显著低于对照组。     

转Cry1Ac+Cry2Ab棉对棉铃虫的控制作用及对天敌捕食烟粉虱功能反应的影响

文章以转Cry1Ac基因棉(中棉所41)和常规棉(中棉所49)为对照,研究了转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉(639020)在棉花生长的关键时期——蕾期(二代棉铃虫发生期)、花期(三代棉铃虫发生期)和花铃期(四代棉铃虫发生期)对棉铃虫的控制作用,同时研究了639020棉田主要捕食性天敌(中华草蛉幼虫、龟纹瓢虫、小花蝽和草间小黑蛛)对烟粉虱的捕食功能,明确了639020棉花在生长的关键时期对棉铃虫的控制效果及对棉田主要捕食性天敌捕食功能反应的影响。结果表明,639020棉花对二代和三代棉铃虫具有良好的控制作用,抗虫性分别比中棉所41提高了52.85%和16.22%,其中前者差异达显著水平,后者差异不显著。在棉花蕾期、花期和花铃期,639020棉田棉铃虫落卵量都比中棉所41棉田和中棉所49棉田低(除二代棉铃虫发生期);棉铃虫幼虫数量都极显著低于常规棉,且都低于防治指标,但与中棉所41棉田无显著差异。639020棉田中华草蛉、龟纹瓢虫、小花蝽和草间小黑蛛对烟粉虱的捕食功能与中棉所41棉田和常规棉田相比无显著变化。研究结果以期为新型转基因棉花环境安全性研究及其外源基因的抗虫遗传效应和生产应用前景进行安全性评价。     

棉铃虫中肠钙粘蛋白、氨肽酶N及碱性磷酸酯酶的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响

【目的】Cry1A和Cry2A类Bt蛋白通过特异性地与昆虫中肠上的受体蛋白结合而发挥杀虫作用,现已广泛应用于转基因抗虫作物。本研究旨在进一步明确Cry2A类蛋白的作用机制和Cry1A受体蛋白在Cry2A发挥毒力中的作用。【方法】本研究首先提取了棉铃虫Helicoverpa armigera的BBMV,制备了钙粘蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)和碱性磷酸酯酶(ALP)3种受体蛋白的抗体和抗血清;然后,利用Western blot检测BBMV上这3种受体蛋白后,利用抗体封闭技术比较了敏感棉铃虫和Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中3种受体蛋白的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响。【结果】对敏感品系棉铃虫,这3种已知的Cry1Ac受体蛋白抗血清显著地降低了Cry1Ac和Cry2Aa的毒力。其中APN抗血清对Cry1Ac毒力的影响最大,棉铃虫幼虫的死亡率降低了84.44%;ALP抗血清对Cry2Aa的毒力影响最大,棉铃虫幼虫死亡率比对照降低了71.04%。Cry1Ac对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力显著降低,Cry2Aa的毒性也减弱。在Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中,3种受体抗血清对Cry1Ac的影响比在敏感棉铃虫中的影响小,尤其是CAD和APN抗血清对Cry1Ac毒力的抑制率显著低于在敏感棉铃虫中的抑制作用;CAD和ALP抗血清对Cry2Aa毒力的影响与在敏感棉铃虫中的影响差异不显著,但APN抗血清可以显著降低Cry2Aa对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力。【结论】棉铃虫CAD,APN和ALP不仅参与了Cry1Ac的杀虫过程,也对Cry2Aa毒力有一定的影响,而且这3种蛋白可能与棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Aa产生抗性及交互抗性相关。     

转基因(Cry1Ac)抗虫棉对土壤微生物的影响

对不同种植年限的转基因(Cry1Ac)抗虫棉田土壤中主要微生物数量变化进行了测定,结果表明：（1）种植转基因抗虫棉后对土壤微生物细菌、放线菌和真菌数量的影响趋势基本相似;（2）种植抗虫棉1年后,土壤中细菌、放线菌、真菌数量将有所增加,连续4年达到高峰,然后数量开始下降,连续种植7年后,棉田微生物数量接近于种植1年的棉田;（3）种植1年后又种植非转基因棉花的棉田,土壤微生物数量低于种植1年抗虫棉的棉田,与种植非转基因棉的数量无明显差异。由此可见,种植转基因抗虫棉对土壤微生物数量有一定的影响。     

棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达分析

【目的】通过对棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达谱分析,进一步明确Polycalin基因在抗性中发挥的作用,为棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性治理提供理论依据。【方法】通过RACE结合PCR技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的Polycalin基因表达量,比较了棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料后,Polycalin基因表达量的变化。【结果】该基因全长序列为2 955 bp,开放阅读框为2 781 bp,编码926个氨基酸(Gen Bank登录号为KP100652);预测蛋白的分子量为101.68 ku,等电点为4.57。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,C末端存在2个GPI结合位点。Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达,幼虫期表达量较高,尤其在1~3龄幼虫体内表达量最高,在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫4龄幼虫取食含活化Cry1Ac蛋白的人工饲料后,Polycalin基因的表达受到抑制。【结论】研究结果可以为进一步揭示Polycalin基因的功能及其在Bt杀虫机制中的作用奠定基础。     

棉铃虫对Bt生物农药早期抗性及与转Bt基因棉抗虫性的关系

用饲料感染法建立了棉铃虫Helicoverpa rmigera(Hubmer)敏感品系(SUS1)对Bt生物农药的敏感毒力基线和区分剂量,1995年测定了五省六县棉铃虫初孵幼虫对Bt生物农药的敏感性,结果表明：山东阳谷、河北邯郸、河南新乡、安徽萧县及江苏丰县棉铃虫已产生早期抗性,抗性个体百分率为5%～10%,与敏感品系相比,LC₅₀值稍有增加,但斜率b值明显变小;而江苏东台棉铃虫仍属敏感。这是国内外首次诊测到棉铃虫对Bt生物农药抗性。用棉叶喂饲法测定比较了转Bt基因棉花品系对不同种群棉铃虫的抗虫性效果,结果表明：用早期抗性的阳谷和新乡棉铃虫初孵幼虫接虫5d后平均死亡率较敏感品系下降16%～29%,说明棉铃虫对Bt农药与转Bt生物基因棉花品系间存在交互抗性。还讨论了Bt农药的抗性治理对策。     

Bt毒蛋白在转Bt基因棉中的表达及其在害虫-天敌间的转移

以常规棉泗棉3号作为对照,采用酶联免疫生测法（ELISA）和室内生物测定法,研究了转Bt基因棉新棉33B和GK-12不同组织器官中Cry1Ac或Cry1Ab毒蛋白的表达及其向靶标害虫（棉铃虫）、非靶标害虫（棉蚜）以及天敌（龟纹瓢虫）的传递和影响。研究结果表明,新棉33B各组织器官中Bt毒蛋白的表达量较高,为79.7～1 390.0 ng/g鲜重,GK-012较低为165～2640 ng/g鲜重。在花盛期,新棉33B各组织器官中Bt毒蛋白的表达量依次为：柱头、花 >子房、花瓣>群尖;而5～7叶期的初展嫩叶、现蕾初期的幼蕾及花铃期的幼铃表达量相当,而且与花盛期群尖的表达量没有明显区别。同样处于花盛期的GK-12,其各组织器官中Bt毒蛋白的表达量依次为：花药>柱头>花瓣>群尖>子房;而5～7叶期的初展嫩叶、现蕾初期的幼蕾及花铃期的幼铃表达量相当,而且与花盛期群尖的表达量没有明显差异。常规对照棉的幼铃、花药、柱头以及子房中痕量Bt毒蛋白的存在可能与传粉昆虫等的活动有关。在转Bt基因棉田采集的棉蚜和棉铃虫老龄幼虫,其体内均可检测到Bt毒蛋白;在新棉33B棉田采集的龟纹瓢虫幼虫和成虫体内也可检测出Bt毒素。当以Bt棉田的棉蚜饲喂龟纹瓢虫时,龟纹瓢虫的生长发育、存活以及繁殖等基本没有受到影响。