首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到10条相似文献,搜索用时 31 毫秒
1.
根据已报道的草鱼免疫球蛋白IgM、IgZ和IgD的序列设计表达引物进行PCR扩增,将扩增片段克隆至表达载体pET-32a,并在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行诱导表达。利用亲和层析法纯化表达的重组蛋白,然后免疫日本大耳白兔,获得兔抗IgM、IgZ和IgD的抗血清。经免疫印迹检测,表明IgM、IgZ和IgD的表达产物能够被兔多克隆抗体特异性识别。应用兔抗草鱼IgM和IgZ的多克隆抗体,对草鱼多种器官、组织提取的总蛋白进行免疫印迹检测,在肠、头肾、中肾、皮肤、脾脏、脑、鳃和血液中都检测到IgM和IgZ的表达。  相似文献   

2.
在前期研究克隆得到黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)全长cDNA的基础上,为进一步研究黄颡鱼免疫球蛋白M(IgM)重链的生物学功能,设计特异性引物PCR扩增获得了编码成熟免疫球蛋白M重链基因的编码序列。将该基因编码片段连接到原核表达载体pQE30中,构建黄颡鱼IgM重链的重组表达质粒IgM-pQE30。该重组质粒经酶切和测序鉴定后,转入表达宿主大肠杆菌M15中诱导表达,在30℃下,经0.2 mmol/L IPTG诱导表达8 h,可获得大量以包涵体形式存在的黄颡鱼IgM重链蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western blotting分析表明,新增的62 kDa蛋白条带与预期值相符,且能与鼠源抗6×His的单克隆抗体特异性结合,证明黄颡鱼IgM重链基因获得了高效原核表达。为进一步纯化该蛋白制备特异抗体,研究其生物学功能奠定了基础。  相似文献   

3.
从大鲵皮肤cDNA文库中,筛选出大鲵铁蛋白重链AdFTH的cDNA序列,其全长为864 bp,开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸,5′和3′非翻译编码区(Untranslated region,UTR)分别为120 bp和214 bp,预测蛋白质的分子量为20.6 kD,理论等电点PI为5.41,预测蛋白无信号肽及跨膜结构,在5′-UTR的22—51 bp处有一个特殊的铁反应元件(Iron response element,IRE)。同源性和系统进化分析表明,铁蛋白重链在进化上有着较高的保守性。实时定量PCR结果表明,大鲵铁蛋白重链mRNA在各个组织中广泛表达,其中肝脏的表达量高于其他8种组织,表明肝脏是大鲵主要的参与铁储存代谢的器官。成功构建了大鲵铁蛋白重链的重组表达载体pET32a-AdFTH,利用大肠杆菌Escherichia coli BL21表达系统和Ni2+亲和层析方法,获得了纯度较高的重组大鲵铁蛋白,并证实重组大鲵铁蛋白(Recombinant AdFTH protein,rAdFTH)具有氧化和吸收铁离子的功能,为进一步制备AdFTH抗体了解其在大鲵体内的多种作用机制打下坚实的基础。  相似文献   

4.
从大鲵皮肤cDNA文库中,筛选出大鲵铁蛋白重链AdFTH的cDNA序列,其全长为864 bp,开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸,5′和3′非翻译编码区(Untranslated region,UTR)分别为120 bp和214 bp,预测蛋白质的分子量为20.6 kD,理论等电点PI为5.41,预测蛋白无信号肽及跨膜结构,在5′-UTR的22—51 bp处有一个特殊的铁反应元件(Iron response element,IRE)。同源性和系统进化分析表明,铁蛋白重链在进化上有着较高的保守性。实时定量PCR结果表明,大鲵铁蛋白重链mRNA在各个组织中广泛表达,其中肝脏的表达量高于其他8种组织,表明肝脏是大鲵主要的参与铁储存代谢的器官。成功构建了大鲵铁蛋白重链的重组表达载体pET32a-AdFTH,利用大肠杆菌Escherichia coli BL21表达系统和Ni2+亲和层析方法,获得了纯度较高的重组大鲵铁蛋白,并证实重组大鲵铁蛋白(Recombinant AdFTH protein,rAdFTH)具有氧化和吸收铁离子的功能,为进一步制备AdFTH抗体了解其在大鲵体内的多种作用机制打下坚实的基础。  相似文献   

5.
用定向克隆法构建了枣树(Ziziphus jujubaMill.)快速生长初期结果枝的cDNA文库,经过重组质粒的筛选,克隆获得两个扩展蛋白基因cDNA全序列,分别命名为ZjEXP1(GenBank登录号:FJ449891)和ZjEXP2(GenBank登录号:FJ449892)。ZjEXP1全长1 037 bp,包含编码254个氨基酸的完整开放阅读框;ZjEXP2全长905 bp,包含编码251个氨基酸的完整开放阅读框。两个序列有共同的结构特征,即在N-末端有8个保守的半胱氨酸残基的丰富域,C-末端有4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有一个组氨酸(His-Phe-Asp,HFD)功能域。两者之间的氨基酸同源性为74.0%。从已知的扩展蛋白基因家族的进化分析表明,ZjEXP1和ZjEXP2由一个祖先进化而来,又分别属于两个不同的分支。  相似文献   

6.
以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。  相似文献   

7.
通过构建东亚三角涡虫(Dujesia japonica)cDNA文库,随机挑选重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获得1个三角涡虫新基因——Rab蛋白基因(DjR),涡虫Rab蛋白cDNA全长2 141 bp,开放性阅读框(ORF)621bp,编码206个氨基酸,相对分子量为23.1 kD,等电点6.59,属亲水性蛋白,主要定位于细胞质中,在氨基酸第20和21位之间有信号肽剪切位点。有8个磷酸化位点。含有小G蛋白家族5个保守的鸟苷酸结合区域。同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的其他23个物种的相似性为53%-90%,且符合种属之间的进化关系。  相似文献   

8.
通过5’-RACE获得德国小蠊变应原Bla g 8基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,建立系统进化树,为进一步研究奠定基础。通过5’-RACE技术,PCR扩增获取编码德国小蠊变应原Bla g 8蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法分析预测Bla g 8蛋白的信号肽、疏水性、跨膜区、二级结构、三级结构;建立系统进化树;构建原核表达载体pET32a-B8,IPTG诱导重组蛋白表达,并用His-tag抗体Western blotting验证。结果显示,获得编码德国小蠊变应原Bla g 8的全长cDNA序列,其完整阅读框含618个碱基,编码205个氨基酸。序列分析显示该蛋白,肌球蛋白轻链,具有EF手蛋白保守功能域。IPTG诱导获得重组蛋白。获得德国小蠊Bla g 8的完整cDNA序列,成功构建重组原核表达质粒pET32a-B8,并表达出融合蛋白。  相似文献   

9.
从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。  相似文献   

10.
菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析   总被引:7,自引:0,他引:7       下载免费PDF全文
以耐盐的菠菜mRNA为模板,经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR),扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pUC19转化至E.coli DH5α菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99.8%,氨基酸序列同源性达99.6%。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号