鸭甲肝病毒1型和3型间接ELISA方法的建立与应用

【目的】研究鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)1型VP3和3型VP1串联基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测的间接ELISA方法。【方法】设计2对特异性引物,提取鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,分别RT-PCR扩增得到714bp的DHAV-1VP3和720bp的DHAV-3 VP1基因,并克隆至p MD18-T载体中,然后依次将DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1定向插入p ET-32a(+)表达载体,获得重组表达载体p ET-1VP3-3VP1,进行IPTG(Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside)诱导表达分析,以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并应用于临床。【结果】经IPTG诱导表达,在大肠杆菌中可稳定、高效地表达DHAV-1VP3-3VP1蛋白。Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白与DHAV-1和DHAV-3阳性血清均能发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/孔,血清最佳稀释度为1∶200,临界值为OD6 50值≥0.38,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与中和试验分别检测DHAV-3阳性血清,两种方法的符合率各为96.3%和96.7%;初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于DHAV-1和DHAV-3抗体的检测。     

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

[目的]研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法.[方法]采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与Pmd18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒.然后定向插入到Pet-32a( )表达载体,筛选原核表达载体Pet-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床.[结果]DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达.Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5 ug/孔,血清最佳稀释度为1:100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性.通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测.[结论]以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测.     

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2Ⅰ蛋白主要抗原域VP2Ⅰ融合蛋白的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性标准初步定为OD490>0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1。     

牛副流感病毒3型HN基因原核表达及间接ELISA方法建立

用构建的HJ-1株牛副流感病毒3型HN基因原核表达载体pQE30-HN,在E.coli XL1Blue中表达了重组HN蛋白,并用电洗脱方法从电泳凝胶中纯化了该重组蛋白作为包被抗原,建立了检测该病毒抗体的ELISA方法。建立的ELISA最佳工作条件分别是:抗原浓度为6μg/mL,血清稀释度为1∶50,封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件为37℃60min,酶标抗体工作浓度为1∶10 000;阳性临界值为OD450≥0.30。该方法与病毒中和试验符合率高达96%,板内和板间重复性试验变异系数均小于10%,重复性较好。该方法与牛冠状病毒、传染性鼻气管炎病毒和呼吸道合包体病毒阳性血清无交叉反应。应用该方法检测黑龙江省部分地区323份奶牛血清样本,对牛副流感病毒3型抗体血清阳性率为57.89%。该ELISA方法的成功建立为进一步研发ELISA试剂盒提供了技术基础。     

猴B病毒抗体ELISA检测方法的建立和应用研究

目的　建立猴B病毒抗体ELISA检测方法。方法　采用方阵滴定法 ,比较不同血清稀释度、3种酶结合物、2种抗原对检测结果的影响 ,与国外同类参比实验室进行检测结果的比较 ,确定ELISA法的最佳实验条件。结果　HSV抗原包被浓度 10 μg ml,抗人IgG HRP为 1∶2 0 0 0时 ;或B病毒抗原包被浓度 10 μg ml,抗人IgG HRP为1∶4 0 0 0时 ,阴性血清和阳性血清的A值差距最大。与国外B病毒检测专业实验室的检测结果符合率分别为98 0 2 %和 97 5 2 %。结论　建立了猴B病毒抗体的ELISA检测方法 ,提高了检测方法的准确性。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立

将已获得的含猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域编码基因VP2I重组酵母菌株在优化的条件下进行诱导表达,表达产物蛋白含量达227.6μg/ml,在此基础上以重组蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,结果表明抗原最佳包被浓度5.69μg/ml,而血清最佳稀释倍数为1∶80.阳性标准初步定为:OD待测样品＞0.5,且OD待测样品/OD阴性血清＞2.0.采用iVP2I-ELISA对猪血清样品进行检测,结果显示iVP2I-ELISA与HI试验的符合率为97.2%,与国外同类试剂盒的符合率达到91.2%.     

小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

本研究旨在建立小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法。以H蛋白4个反应原性较好的B细胞表位串联后为检测抗原,在确定抗原包被量和血清稀释度,优化血清和酶标二抗反应时间的基础上,用ROC曲线分析确定检测临界值,建立了小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法,然后对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价。结果显示,建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法最佳抗原包被浓度为1.5×10^-6μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶100;血清及酶标二抗孵育时间均为10 min,检测方法的临界值为S/P=9.77%,批内及批间变异系数均小于10%;与口蹄疫、羊痘、蓝舌病及山羊传染性胸膜肺炎阳性血清不发生交叉反应;用建立的化学发光法和市售小反刍兽疫抗体cELISA试剂盒平行检测247份田间血清,两者相对符合率为94.33%,但化学发光法敏感性更高。研究结果表明,建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析方法灵敏、特异、稳定,可用于田间血清样品小反刍兽疫抗体检测。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列（AB020025）针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a（＋）载体中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

猴血SV40抗体和SV40 DNA携带关系分析

目的　检测 5 7份恒河猴血清及对应的猴血中抗SV4 0抗体、SV4 0DNA的携带情况 ,找出抗体滴度与DNA携带的相关关系。方法　用间接免疫荧光法检测猴血中SV4 0中和抗体 ,聚合酶链反应 (PCR)法检测SV4 0st抗原DNA的携带情况。结果　 5 7份猴血清中 ,SV4 0抗体阳性率为 93% (5 3 5 7) ,抗体滴度最高为 1∶12 80 ,最低为 1∶10 ,GMT为 15 9.5 6 ,PCR检测猴血淋巴细胞SV4 0DNA阳性率为 2 4 .5 6 % (14 5 7) ,当抗体为 1 80以下时 ,病毒整合于血细胞 ,1∶80以上时 ,对st抗原基因的整合有抑制作用。结论　恒河猴SV4 0DNA的携带情况与抗体阳性和滴度呈反相关     

家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素（PRN）蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

Dot-ELISA检测莱姆病血清抗体的实验研究

经实验研究,建立了检测莱姆病血清IgG的Dot-ELISA方法。阻断试验表明,本法具有特异性。经对10例伯氏疏螺旋体人工感染兔血清和24例正常兔血清标本的检测证实,该法与常规ELISA法检测的符合率为100％。重复性试验表明其重复性良好。     

IBDV多聚蛋白基因真核表达质粒的构建与表达

将IBDV上海超强毒株的多聚蛋白基因(vp2-4-3)克隆入真核表达载体pALTER-MAX,构建成功pALTER-MAX-VP2-4-3真核表达质粒,经纯化后,pALTER-MAX-VP2-4-3在Lipofectamie^TM2000介导下转染Vero细胞、11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)和肌肉注射2日龄的雏鸡,1周后,分别提取细胞或组织中的总DNA或总RNA,用DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号;转染的Vero细胞飞片和肌肉冰冻切片,进行免疫荧光检测均呈现阳性结果;转染的鸡胚CAM匀浆上清,用兔抗IBDV超强毒的高免血清,经Dot—ELISA检测呈现阳性。表明转染后基因获得表达,表达的蛋白具有免疫反应性。     

Dot-ELISA法检测血液及唾液HIV抗体的应用评价

评价人类免疫缺陷病毒1+2型抗体检测试剂盒(Dot-ELISA法)检测血清和唾液样本的临床性能。采用对照试验研究,选取背景清晰的研究对象200例,采集同一研究对象的血清和唾液样本,应用万泰生物药业公司生产的人类免疫缺陷病毒1+2型抗体检测试剂盒作为考核试剂,法国生物梅里埃公司生产的人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(ELISA法)作为参考试剂,考核试剂检测结果与参考试剂及研究对象背景进行比较分析。考核试剂检测血清HIV抗体与参考试剂相比较,阳性符合率100%,阴性符合率100%,总符合率100%,Kappa值1.00,一致性为最强;考核试剂检测唾液HIV抗体与参考试剂检测结果相比较,阳性符合率98.78%,阴性符合率100%,总符合率99.50%,Kappa值0.99,一致性为最强。Dot-ELISA法人类免疫缺陷病毒1+2型抗体检测试剂盒对血清及唾液样本检测性能优越,适合HIV抗体快速筛查。     

鹅细小病毒长春分离株主要结构蛋白(VP2-VP3)基因的原核表达

根据国外巳发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列,设计并合成了一对用于GPV主要结构蛋白（VP2-VP3）基因表达的引物。利用合成的引物,扩增并鉴定了GPV中国长春株（GPV CC株）的VP2-VP3基因。将扩增的目的的基因插入到原核表达载体pET28(a)的多克隆位点,构建了表达GPV,VP2-VP3基因的原核载体pEGVP1。重组表达载体质粒转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到大小分别为75000和58000的表达蛋白带。Western blot分析表明,表达产物具有很好的特异性。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种快速、特异、敏感的检测血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的方法。【方法】利用生物学软件对PEDV S蛋白进行抗原位点分析,选择S蛋白的主要抗原表位区进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,经过条件优化、特异性和重复性试验,建立一种针对血清中PEDV抗体的间接ELISA检测方法。【结果】表达了重组S蛋白,重组的S蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应,并建立一种基于重组S蛋白的间接ELISA检测方法。组内及组间变异系数均小于10%,重复性较好。建立的间接ELISA检测方法分别与商品化PEDV抗体检测试剂盒和Western-blot鉴定结果相比,两者符合率分别为86.67%和88.89%。【结论】建立的间接ELISA方法可以用于PEDV抗体的检测。     

致病性迟缓爱德华菌的检测

系统检测了 2 5株迟缓爱德华菌 (Edwardasiellatarda ,Et)的胞外产物 (ECP) ,包括溶血素、胞外蛋白酶 (ECPase) ,并用Et强致病株JEL4的ECP抗血清作Dot ELISA检测各株Et的ECP ,同时对小鼠和剑尾鱼作致病性试验。试验表明 ,具动物致病性的菌株溶血素检测均为阳性 ,ECPase与致病性无关。JEL4ECP的Dot ELISA结果与动物致病性的符合率达 1 0 0 %。在此基础上 ,建立了致病性Et的检测方法 ,该方法只需作简便的平板溶血试验和Dot ELISA ,即可检测Et的ECP ,无须作动物试验 ,从而简化了致病性Et的检测程序 ,为研制检测试剂盒奠定了基础。     

Leptospiral glycolipoprotein as a candidate antigen for serodiagnosis of human leptospirosis

Aims:  Development of a simple, specific, rapid and inexpensive Dot-ELISA test for early diagnosis of human leptospirosis.
Methods and Results:  Serum samples from 90 patients diagnosed with leptospirosis were analysed by Dot-ELISA test incorporating Glycolipoprotein (GLP) antigen from serovars Copenhageni and Patoc. Results were compared with those obtained with microscopic agglutination test, currently, the gold standard reference serological method. Serum samples from healthy blood bank donors and patients diagnosed with diseases other than leptospirosis were used as negative controls. The specificities of both GLP-based assays were 97·1% and 100% with serum samples from patients with other diseases and with serum samples from healthy control group, respectively. With serum samples from patients with acute leptospirosis, sensitivity was 76·6% with Dot-ELISA Copenhageni and 90·0% with Dot-ELISA Patoc. With serum samples from patients in convalescence, sensitivity was 100% with both GLP-based assays.
Conclusions:  This Dot-ELISA provides a candidate antigen for serodiagnosis of leptospirosis during all phases of illness and could be a good alternative method for the early diagnosis of leptospirosis.
Significance and Impact of the Study:  The Dot-ELISA test is simple, specific, rapid and inexpensive. It is suitable for identifying a large number of samples and, hence, reducing the death rate of patients with leptospirosis.     

空肠弯曲菌FlaA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】原核表达空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA,并制备其单克隆抗体。【方法】克隆目的基因并将其构建到pET30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,分别以变复性纯化后的rHis-FlaA、rGST-FlaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和单抗腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析单抗特异性。【结果】成功构建pET30a(+)-flaA和pGEX-6p-1-flaA重组原核表达质粒,并融合表达rHis-FlaA和rGST-FlaA蛋白,Western blot试验显示天然蛋白多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应,表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗FlaA的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为2D12、5E12、6A9,其Ig亚类分别为IgG2a、IgG1、IgG1,腹水效价分别为1∶102400,1∶102400和1∶51200;Western blot试验显示,3株单抗均能与表达rHis-FlaA重组蛋白的细菌发生特异性反应;Dot-ELISA试验表明,3株单抗均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。【结论】本研究制备的单克隆抗体有较高特异性,具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌鞭毛蛋白的生物学特性、致病机理,以及建立快速检测技术奠定基础。     

基于TbpA蛋白的副猪嗜血杆菌抗体间接酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glasser’s Disease)的病原体,抗生素治疗和疫苗接种对于防控该病效果不明显,建立快速、准确的抗体检测方法尤为重要。【目的】利用表达纯化的HPS转铁结合蛋白A(TbpA)建立检测HPS抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。【方法】PCR扩增HPS的tbpA基因并与原核表达载体pET-SUMO连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入Escherichia coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定产物。以纯化的TbpA蛋白作包被抗原,通过各种反应条件优化,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,并进行临床应用与评价。【结果】该方法的最佳条件:包被抗原浓度为5μg/mL,4℃过夜;5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h;血清稀释度为1:1600,37℃孵育45 min;酶标二抗稀释度为1:5000,37℃作用30 min;显色时间为37℃ 5 min。该方法可特异性检测HPS抗体,阳性血清稀释至1:12800仍可检出,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应,批内及批间变异系数均小于10%,与全菌体包被间接ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western Blot比较,该方法总符合率分别为90.00%、86.67%和90.00%,其中阳性符合率分别为90.38%、88.46%和92.00%,阴性符合率分别为87.50%、75.00%和80.00%。该方法检测免疫抗体阳性率为80.00%,感染抗体阳性率为19.50%。【结论】基于TbpA蛋白建立的HPS抗体间接ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为HPS的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段。     

一种新型H5N1禽流感病毒血凝素抗原快速检测试剂的建立

利用5株广谱特异性抗H5亚型血凝素单克隆抗体和酶联免疫渗滤技术成功地建立了一种适于现场检测H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的抗原快速检测试剂H5-HA(Ag)Dot-ELISA。该试剂对41株代表当前亚洲地区流行的各种遗传变异亚系H5N1禽流感病毒检测均为阳性,对多数毒株的分析灵敏度优于0.1个血凝滴度(HA titer),其中部分优于0.01个血凝滴度;比较该试剂与早期开发的同类ELISA试剂,发现前者对后者未能检出的H5N1新变异株检测均为阳性;利用该试剂和商品化Directigen Flu A(BD)试剂检测两株H5N1病毒株,提示前者灵敏度高于后者;该试剂对一株H5N1病毒的检测灵敏度与标准RT-PCR相当;该试剂对24株非H5亚型病毒检测均为阴性,显示出良好特异性。以上结果提示,此研究建立的H5N1病毒抗原快速检测试剂在H5禽流感现场检测上具有较好的应用前景。