威宁绵羊GHR基因克隆及组织表达

本试验以6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公母羊为研究对象,利用分子手段对威宁绵羊GHR基因编码区序列进行克隆,并进行生物信息学分析,此外,本试验同时采用实时荧光定量PCR的手段对GHR基因在威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及背最长肌6个组织中mRNA水平上的表达规律进行探究,结果显示:威宁绵羊GHR基因CDS区序列长度为1 905 bp,发现2个SNP位点。GHR基因在威宁绵羊各组织均有不同程度的表达,在不同性别、不同生长阶段相同组织中的表达具有一定的显著性差异。     

北极狐GHR基因cDNA的克隆及序列分析

本文根据狗(AF133835)的GHR基因cDNA编码全序列设计了三对引物,利用RT-PCR方法克隆出北极狐GHR基因编码区全长cDNA序列(GenBank accession No.EU304325)。结果表明,北极狐GHR的ORF为1917bp,编码638个氨基酸的前体蛋白,由18个氨基酸的信号肽和620个氨基酸的成熟肽组成。通过同源性比较发现北极狐与狗的同源性最高,达到98%。另外,利用邻接法(NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,北极狐与狗先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。另外,通过氨基酸对位序列比较发现,北极狐GHR在氨基酸序列上存在明显的特异性,如45和451位分别为A和E,而其它物种均分别为T(大鼠为K)和A(牛羊为V,鼠为T)。     

草地藏系绵羊IGF-I基因的克隆及序列分析

采用Trizol法从草地藏系绵羊肝脏中提取总RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增并克隆测序,获得长度为589bp的胰岛素样生长因子(IGF-I)cDNA序列,共编码70个氨基酸的成熟肽。分析显示,草地藏系绵羊与其他绵羊IGF-I的cDNA编码区序列存在1个碱基差异,同源性达99.78%。     

草地藏系绵羊IGF-Ⅰ基因的克隆及序列分析

采用Trizol法从草地藏系绵羊肝脏中提取总RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增并克隆测序,获得长度为589 bp的胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)cDNA序列,共编码70个氨基酸的成熟肽.分析显示,草地藏系绵羊与其他绵羊IGF-Ⅰ的cDNA编码区序列存在1个碱基差异,同源性达99.78%.     

单碱基编辑系统介导欧拉藏绵羊GDF9、FecB多胎基因的定点突变

本研究旨在利用单碱基编辑系统(single base editing system)实现欧拉藏绵羊成纤维细胞FecB和GDF9基因靶位点A到G和C到T的碱基替换并检测其编辑效率。首先设计合成靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA序列,再分别连接至epi-ABEmax、epi-BE4max质粒,构建载体并电转至欧拉藏绵羊成纤维细胞,最后对阳性细胞FecB和GDF9基因进行Sanger测序鉴定靶位点突变结果,并通过T-A克隆估算单碱基编辑系统的编辑效率。结果显示获得了靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA,并构建使欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因单碱基突变的载体,FecB基因靶位点编辑效率为39.13%,GDF9基因靶位点(G260、G721、G1184)编辑效率分别为10.52%、26.67%和8.00%。本研究运用单碱基编辑系统在欧拉藏绵羊成纤维细胞上实现了FecB和GDF9基因靶位点突变,为改良欧拉藏绵羊一胎多羔的繁殖性状奠定理论基础。     

绵羊EGFR基因的克隆、表达及序列分析

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是酪氨酸激酶受体家族成员之一,不仅参与细胞增殖、生长和凋亡等多种生命活动,也可调节哺乳动物的乳腺发育及泌乳维持,但对绵羊EGFR基因的序列特征及组织表达情况鲜有报道.本试验以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)及低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)母羊为研究对象,利用RT-PCR、克隆及测序技术获得绵羊EGFR基因完整的CDS区,分析了 EGFR蛋白的结构特征及理化性质,利用RT-qPCR技术研究了基因的组织表达情况.结果表明,绵羊EGFR基因CDS区全长为3 627 bp,编码1 208个氨基酸.绵羊EGFR的氨基酸序列在各物种间较保守,与黄牛EGFR的氨基酸序列同源性最高.EGFR为跨膜蛋白,包含111个磷酸化位点,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.网络互作分析表明EGFR蛋白与肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、表皮调节素(EREG)、双调蛋白(AREG)及生长因子受体结合蛋白2(GRB2)结合发挥作用.EGFR主要参与MAPK,PI3K/AKT,JAK/STAT及Wnt信号通路,从而参与了动物的乳腺发育及泌乳功能的调节.RT-qPCR结果表明,绵羊EGFR基因的表达具有组织特异性、时空特异性和品种特异性.该基因在所研究的8个组织中均表达,但在肾脏、卵巢、肝脏、乳腺和肺脏组织中的表达量较高;在小尾寒羊的乳腺组织中,该基因在空怀期的表达量显著高于泌乳高峰期的(P＜0.05);在泌乳高峰期的乳腺组织中,该基因在小尾寒羊中的表达量高于甘肃高山细毛羊的.本试验为深入研究绵羊EGFR基因的泌乳生物学功能提供了基础数据.     

藏系绵羊ZFX/ZFY基因片段进化分析

目的:获得X染色体、Y染色体在进化上是独立进行的依据.方法:用PCR方法扩增并克隆藏系绵羊ZFX/ZFY基因片段并测序,对ZFX/ZFY基因片段进行了序列比对.结果:扩增的ZFX/ZFY基因片段长度为447bp,该对基因比对结果是总的同源相似率为80.76%,ZFY基因的同源性在96.4～99.3%之间,而ZFY基因的同源性在95.3～98.4%之间;在相应148个氨基酸中,ZFX基因的氨基酸差异为2个,而ZFY基因的氨基酸差异为12个.结论:在进化过程中ZFY基因比ZFX基因更活跃,而ZFX基因较为保守,为研究X染色体、Y染色体在进化上的差异提供参考.     

绵羊cdh1基因cDNA全编码区的克隆及序列分析

在哺乳动物成体睾丸中,精子发生的过程开始于未分化的A型精原细胞的干细胞群.目前已有报道在小鼠未分化的A型精原细胞中特异性表达钙依赖性跨膜黏着蛋白基因(cdh1),但绵羊的cdh1基因全序列未见报道.为了更好地研究绵羊精原干细胞的特性,根据已报道的其他物种的cdh1基因的cDNA保守区设计引物,从成年蒙古绵羊睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆方法克隆了蒙古绵羊cdh1基因cDNA全编码区.DNA序列测定结果与牛的核苷酸序列比对,同源性为96.5％,说明该基因在进化上是高度保守的.这为制备绵羊CDHI的抗体奠定了基础,并且为绵羊精原干细胞的分子水平鉴定提供了研究备件.     

蒙古绵羊 tnp1基因cDNA全编码区的克隆及序列分析

过渡蛋白1基因(tnp1)是圆形精子细胞特异表达的基因.绵羊tnp1基因的DNA序列至今尚未报道.为了开展绵羊圆形精子细胞标记基因的研究,根据其他物种tnp1基因cDNA的保守序列设计引物,从成年蒙古绵羊睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆方法,克隆了蒙古绵羊tnp1基因cDNA全编码区.该基因cDNA 长246 bp,包含一个168 bp的ORF,编码含有54个氨基酸的多肽链.DNA序列测定结果与牛的核苷酸序列比对,同源性为94.0%.绵羊tnp1基因的cDNA克隆和序列测定为进一步研究绵羊精子发生过程奠定了基础.     

绵羊高硫角蛋白KAP1.3基因启动子活性分析

旨在研究高硫角蛋白基因启动子及相关调控序列的表达活性。以绵羊基因组为模板,克隆KAP1.3基因启动子序列,对其进行5个系列缺失片段pGL4.10表达载体构建,将不同重组质粒转染小鼠成纤维细胞,通过裂解细胞测定其荧光值方法来检测启动子的表达活性。结果显示,除KAP1.3-P5片段其余片段均具有表达活性,其中KAP1.3-P1片段表达活性最高,而缺失-944至-707处的KAP1.3-P2对启动子的活性没有显著影响,但缺失-944至-394处KAP1.3-P3片段对启动子活性影响比较大,从P3和P4的结果中可以看出,虽然两个片段都缺失了转录因子bHLH的结合位点,但P4的活性比P3高出约20%,由此推测在-394至-195之间可能存在一个负调控元件,在-195和-4之间可能存在一个增强元件,但具体的调控元件还需要再进行细致地分析,优化出活性最高且特异性不变的启动子片段。     

绵羊18号染色体微卫星多态性与后臀发育关系的研究

根据绵羊18号染色体遗传连锁图谱及相关报道, 选择了可能与Callipyge基因连锁和有关的10个高度多态微卫星基因座(ILSTS54、TGLA337、 HH47、TGLA122、BP33、OB2、BM3413、MCM38、MCMA26和CSSM18), 分别对Dorset和Suffolk两个肉羊群体的遗传特性进行了分析。研究发现, 同一微卫星基因座在Suffolk与Dorset群体间的群体遗传参数以及对同一性状的影响情况明显不同。Dorset群体中, 等位基因个数为8~16个, 杂合度为0.8370~0.9252, 多态信息含量为0.8221~0.9167; 而在Suffolk群体中相应参数分别为5~10, 0.7603~0.8913与0.7176~0.8809。对10个微卫星基因座进行臀宽的最小二乘分析, 结果表明: 在Dorset群体中, 微卫星基因座BM3413、MCMA26和CSSM18对臀宽有显著影响(P<0.05), 其余7个微卫星对后臀宽度的影响均未达到显著水平(P>0.05); Suffolk群体中微卫星基因座TGLA122、BM3413、MCM38和CSSM18对绵羊臀宽存在显著或极显著影响(P<0.05或0.01), 其余6个微卫星基因座对臀宽的影响均未达到显著水平(P>0.05)。研究表明, 导致新疆肉羊群体后臀肌过度发育可能是其他基因或QTL的作用。     

Characterization and linkage mapping often sheep microsatellite markers derived from a sheep x hamster cell hybrid

A cosmid library has been constructed from a sheep x hamster cell hybrid containing sheep chromosome t₁, rob (6;24). Clones containing sheep DNA were identified by hybridizing to a total sheep genomic DNA probe. Small fragments (<500 bp) containing (AC)_n microsatellites were subcloned and sequenced. Ten microsatellite markers were characterized and six were mapped back to chromosomes 6 and 24. The remaining microsatellites mapped to chromosome 26, which was shown to be present in a small proportion of cells of the cell line.     

Genetic differentiation between the Old and New types of Serbian Tsigai sheep

Two Tsigai sheep populations exist in Serbia: the Old type, called Čokan, and the New type. It is assumed that the New type results from upgrading Tsigai sheep with exotic genetic material. We investigated genetic diversity and differentiation of these types by analysing 23 autosomal microsatellites. Tests for Hardy-Weinberg proportions, linkage equilibrium between genotypes across loci and the calculation of inbreeding coefficients were performed and the deficiency in the number of alleles within the Tsigai types was examined using a Wilcoxon sign-rank test. The New type displayed a higher level of genetic variability than the Čokan in terms of allele numbers, but the New Tsigai showed a pattern of heterozygosity deficiency. The positive f value for the Čokan suggests the occurrence of inbreeding in this type. The proportion of linkage disequilibrium was below that expected by chance. Exclusion of two loci in Hardy-Weinberg disequilibrium did not alter our conclusions based on the entire data set i.e. the two Tsigai types are clearly differentiated and the New Tsigai type has been influenced by crossbreeding. Therefore, the Čokan Tsigai should be considered as a distinct endangered breed in the FAO classification.     

高原型藏羊和小尾寒羊睾丸小叶及附睾微动脉的解剖学特征

分别从青海和甘肃采集高原型藏羊(Ovis aries)和小尾寒羊睾丸各20枚,用血管铸型技术和扫描电镜方法,研究两品种绵羊睾丸小叶及附睾微动脉的超微形态特征。结果显示,两品种绵羊的睾丸小叶及附睾微动脉走形呈一定程度的弯曲,其中睾丸小叶内离心动脉、离心小动脉及向心小动脉均呈\"树枝\"状分布。研究发现,与低海拔地区的小尾寒羊相比,高原型藏羊睾丸的绳结状动脉具有更密集的螺旋状排布,小动脉分支也较多,并且向心动脉、绳结状动脉、离心动脉、附睾头微动脉的管径也较粗。此外,高原型藏羊睾丸小叶和附睾头微动脉表面的\"梭形\"压痕较浅,而小尾寒羊的则较深;高原型藏羊睾丸小叶毛细血管前微动脉的表面缢痕较多且密集,而小尾寒羊的则相对少而稀疏。研究认为,高原型藏羊睾丸小叶及附睾微动脉的超微形态特征,有利于血管的收缩、睾丸供血及高原环境下精子的成熟,是睾丸对高原环境的适应性特征。     

藏山羊与藏绵羊肺组织结构的对比研究

为了探讨藏山羊（Capra hircus）与藏绵羊（Ovis aries）在高原低氧环境中肺组织结构的差异,采用Gomori醛品红染色及H.E染色对藏山羊和藏绵羊肺组织进行对比研究。结果表明,藏山羊与藏绵羊肺被膜厚度无显著差异（P > 0.05）,但肺被膜中弹力纤维藏山羊显著多于藏绵羊（P < 0.05）。肺泡面积藏山羊与藏绵羊无显著差异（P > 0.05）,但肺泡隔宽度和肺泡隔中毛细血管的数量藏山羊显著高于藏绵羊（P < 0.05）。肺细支气管黏膜皱襞厚度藏山羊与藏绵羊无显著差异（P > 0.05）,但细支气管平滑肌厚度藏山羊显著高于藏绵羊,细支气管黏膜上皮1 mm2中杯状细胞数量藏山羊显著高于藏绵羊（P < 0.05）。外径小于100 μm的肺微动脉中,藏山羊血管平滑肌占外径百分比显著高于藏绵羊（P < 0.05）,而当外径大于100 μm时,两者间差异不显著（P > 0.05）。