L-精氨酸高产菌红曲霉的筛选及发酵初步研究

对不同样品中的真菌进行了L-精氨酸高产菌株的筛选,从红曲米中分离出1株高产L-精氨酸菌株红曲霉H13,其初始发酵液中L-精氨酸产量为1.67 g/L.通过单因素实验对其液体发酵进行研究.结果表明,最佳碳源是可溶性淀粉,最佳浓度为10％,最佳氮源是蛋白胨,最佳浓度为3％,最佳pH值4.5,温度30℃,种子培养时间为18 h,摇瓶装液量50 mL/250 mL.转速为120 r/min,发酵时间7d.在此条件下进行发酵培养,所得发酵液产L-精氨酸4.08 g/L,菌丝体干重为10.32 g/L,菌丝体中L-精氨酸含量为24.17 mg/g.     

褐黄孢链霉菌原生质体制备与再生

以纳他霉素产生菌株褐黄孢链霉菌SG-2002为出发菌株,考察了菌丝体培养基、甘氨酸浓度、培养时间、溶菌酶浓度、酶解温度、酶解时间及再生培养基对原生质体形成与再生的影响.原生质体形成和再生的最佳条件为S培养基中添加1%的甘氨酸,菌丝体培养 30 h,溶菌酶浓度 40 mg/(g菌体干重),酶解温度 30 ℃,酶解时间 60 min.褐黄孢链霉菌的原生质体形成量达到4.0×106 个/mL,再生培养基选择R5′培养基,再生率为9.0%.     

小麦白粉病生防菌G-1菌株原生质体诱变育种

以链霉菌G-1(Streptomyces sp.G-1)为出发菌株,通过研究菌株G-1原生质体形成与再生的条件,发现该菌株在含0.5%甘氨酸的菌丝体培养基中经过二次培养后,所得菌丝体用2 mg/mL溶菌酶在30℃下处理90 min,可获得大量原生质体,其再生率可达8.2%。菌株G-1的原生质体经紫外诱变和宁南霉素抗性筛选后,得到一高产突变株G-1-125,其有效组分A的产量达到794mg/L,较出发菌株提高了180%。     

L-缬氨酸高产菌株的选育研究

以产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为原始菌株,利用注入低能氮离子束进行一系列诱变,获得一株稳定的高产L-缬氨酸突变菌株。摇瓶培养96h后发酵能力可达38.0g·L-1,较出发菌株提高18.01%。通过对摇瓶中葡萄糖、玉米浆浓度及培养条件进行优化,发酵能力达到40.6g·L-1,50L发酵罐的发酵能力可达70g·L-1左右。     

丝氨酸生产菌的筛选及静息细胞培养系统中L-丝氨酸的合成

从广西隆安县沼气池里的残渣中筛选到一株能以甲醇为唯一碳源生长的MB200菌株。根据常规形态特征、生理生化性状及16S rDNA基因序列分析将其鉴定为甲基杆菌属(M ethylobacteriumsp.)。其最佳生长条件为:温度32℃、pH值8.0、甲醇体积分数1.25%。建立了MB200生成L-丝氨酸的静息细胞培养系统。确定静息细胞培养的条件为:甘氨酸质量浓度为10 g.L-1,甲醇50 g.L-1,菌体质量浓度为30 g.L-1,pH8.9,于摇床250 r.m in-1,32℃静息培养48 h,L-丝氨酸产量为7.2 g.L-1。     

基于微生物同化作用的D-丙氨酸生产工艺研究

以L-丙氨酸为唯一碳氮源,从采集的若干土壤中初筛出能够降解L-丙氨酸的菌株;再以D-丙氨酸为唯一碳氮源,复筛出降解L-丙氨酸而不降解D-丙氨酸的菌株。依据菌种对DL-丙氨酸的不对称降解活性,筛选出具有最高的L-丙氨酸降解活性的菌株,并对菌株同化L-丙氨酸的反应条件进行了研究。结果表明:编号为ALA-D82的菌株具有最高的降解L-丙氨酸的能力,经鉴定为酵母菌属。在30℃,控制pH6.0,通气比1:1(V/V)和转速900 r.min-1的条件下,L-丙氨酸降解的速度最大。在最适条件下,1500 g DL-丙氨酸分两部分添加入7 L的反应液中。反应72 h后溶液中的L-丙氨酸被完全降解,提取得到D-丙氨酸晶体,产率和光学纯度分别达到92.13%和99%。     

利用赭曲霉NG1203羟基化齐墩果酸的研究

考察了利用赭曲霉Aspergillus ochraceusNG1203进行C11α-羟基化齐墩果酸生化反应的条件。得出了菌株摇瓶培养最佳培养基配方(g.L-1):葡萄糖20,玉米浆25,酵母膏3,K2HPO41.5,pH 6.0。菌株培养20 h,加入2 mg.L-1的齐墩果酸利于诱导羟基化酶的产生。菌株在28℃下以150 r.min-1振荡培养24 h,加入底物的乙醇溶液,使转化液中齐墩果酸的初始质量浓度达100 mg.L-1,转化液中乙醇体积分数最终达3%。经96 h转化,齐墩果酸转化率可达到10.12%。通过HPLC1、H NMR和13C NMR分析,结果表明产物为C11α-羟基齐墩果酸。     

产γ-聚谷氨酸枯草芽胞杆菌菌株的高效诱变及发酵条件优化

以产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)枯草芽胞杆菌菌株SY-ND为出发菌株,采用新型常压室温等离子体技术对其进行诱变以期获得高产菌株,在诱变致死率为80%~98%的条件下,通过检测突变菌株发酵产γ-PGA的量,筛选得到一株高产菌株SY-ND-SFX029。通过正交试验优化得出最佳培养基条件为:蛋白胨8.0g·L-1、蔗糖45.0g·L-1、L-谷氨酸钠35.0g·L-1。依照该条件经过48h发酵,菌株SY-ND-SFX029的γ-PGA产量达35.3g·L-1,比出发菌株SY-ND的γ-PGA产量18.9g·L-1提高86.8%。     

万古霉素发酵废渣固态发酵生产单细胞蛋白的研究

以万古霉素发酵废渣为唯一培养基,对固态发酵生产单细胞蛋白(SCP)进行了研究.经过筛选得到了一株白地霉HCCB 2267,它能以万古霉素发酵废渣为唯一底物生长.通过菌株驯化和培养条件优化,固态发酵产生的SCP可迭9.42×108个/g干重,其粗蛋白含量达47.24%,氨基酸总量从30.60%提高到46.28%.其优化的培养条件是:培养基起始含水量60%,起始pH 5.0～6.0,接种量15%,培养温度28～30℃,培养时间72h等.此外,筛选到的菌株对废渣中残存的菌丝体有降解作用.     

无载体固定化米根霉重复间歇发酵生产L-乳酸

通过研究影响米根霉菌丝体形态的培养基因素,初步构建了无载体固定化米根霉重复间歇发酵生产L-乳酸的工艺条件.研究结果表明,首批次发酵培养基采用120 g/L葡萄糖,3 g/L硝酸铵,K 和Na 浓度比为1:1,发酵72 h后,米根霉菌体形态为均匀的茵丝体小球,直径为1.0 mm～2.0 mm,此时L-乳酸产量可达100.8 g/L,葡萄糖转化率为84%.在此基础上,利用米根霉菌丝体小球重复间歇发酵16批次,每批次发酵24h,此时葡萄糖转化率均高于75%,L-乳酸产量保持在60.0 g/L以上,米根霉菌丝体小球形态保持稳定.     

红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30~40 h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为：0.3 % lysing enzyme、0.1 % cellulase和1 % snailase的酶组合,30℃作用2.5 h;最适渗透压稳定剂是：1mol /L MgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6 mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5 %和36.4 %。在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC-Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA克获得100个稳定转化子。     

桃褐腐病菌(Monilia fructigena)原生质体制备及再生条件

以桃褐腐病菌(Monilia fructigena)为供试菌株,研究了酶系组成、液体培养基、菌龄、酶解温度、酶解时间对原生质体制备的影响,以及等渗液、固体再生培养基、酶解时间对原生质体再生的影响。结果表明:Fries(1/2)液体培养基培养24h,在10mg/mL崩溃酶+5mg/mL纤维素酶+20mg/mL蜗牛酶+10mg/mL溶菌酶的混合酶液中28°C酶解4h为桃褐腐病菌原生质体制备的最佳条件。采用液体再生涂布平板法,以含Ca2+的STC为等渗液的液体培养基和含蔗糖及Ca2+的Fries(1/2)固体培养基为桃褐腐病菌原生质体再生的最佳条件。经过观察与测定,再生菌株保持了原有的培养性状和致病性,接种桃果实后发病率为100%。     

影响枯草芽胞杆菌和荧光假单胞菌原生质体再生的因素

目的：为了提高再生率,对影响革兰阳性菌枯草芽胞杆菌KR株和革兰阴性菌荧光假单胞菌B13株原生质体再生的因素进行研究。方法：研究了酶解时间,再生方式,再生培养基中稳定剂的种类,Ca^2＋、Mg^2＋、琥珀酸钠、L-色氨酸的浓度及培养基的放置时间对KR和B13株原生质体再生的影响。结果：对KR株酶解20min,采用夹层培养,再生培养基中加入0.6mol/L蔗糖、0.03mol/L Ca^2＋、0.02mol/L Mg^2＋、0.3mol/L琥珀酸钠、0.2mol/L L-色氨酸,培养基在37℃放置72h,原生质体再生率可达42.7%;对B13酶解15min,采用夹层培养,培养基中加入0.6mol/L NaCl、0.02mol/L Ca^2＋、0.01mol/L Mg^2＋、0.3mol/L琥珀酸钠、0.1mol/L L-色氨酸,培养基在37℃放置48h,原生质体再生率可达15.3%。结论：影响革兰阳性菌枯草芽胞杆菌KR株和革兰阴性菌荧光假单胞菌B13株原生质体再生的因素是不同的。     

毛白杨悬浮细胞系的建立及再生植株的获得

以毛白杨基因型TC152无菌苗为材料,研究毛白杨悬浮细胞系建立与植株再生,结果表明,通过悬浮培养和固体培养两种方法诱导毛白杨悬浮细胞分化不定芽,最终获得无菌生根苗。愈伤组织在MS＋1.5mg·L-12,4-D＋30g·L-1蔗糖的液体培养基中振荡培养,12d可建立悬浮细胞系;悬浮细胞系继代培养基为MS＋0.8mg·L-12,4-D＋30g·L-1蔗糖,继代周期为7d,悬浮细胞在MS＋1.0mg·L-16-BA＋0.1mg·L-1NAA＋0.5～1.0mg·L-1ZT＋30g·L-1蔗糖培养基中悬浮培养,可分化大量不定芽,每个培养瓶中可得到40～50个芽,个别不定芽玻璃化;不定芽在1/2MS＋0.6mg·L-1IBA＋20g·L-1蔗糖＋5.5g·L-1琼脂培养基上可分化不定根。悬浮细胞通过固体平板培养增殖为愈伤组织块后,在MS＋1.0mg·L-16-BA＋0.1mg·L-1NAA＋1.0mg·L-1ZT＋30g·L-1蔗糖＋5g·L-1琼脂的固体培养基上,不定芽分化率可达到70.00%。     

Culture of Cotyledon and Hypocotyl Protoplasts from True Potato Seedlings in Solanum tuberosum L.

Culture of protoplast using cotyledon and hypocotyl as the donor tissue from true potato seedlings (TPSs) of 3 breeding lines (DTO-33, ND 860-2 and BN 9815-3) of Solanum tuberosum L. was studied. The cotyledons and hypocotyls of TPSs just extended were excised and digested in an enzyme solution containing 1 % cellulase and 0. 5 % macerozyme for 17—20 h after vacuum infiltration of the tissue in the solution. The protoplasts were cultured in an improved liquid medium and transferred onto solid media for callus culture and shoot regeneration. Some factors affecting the efficiency of cotyledon and hypocotyl protoplast culture were studied. The results showed that using the cotyledons and hypocotyls as donor tissues for protoplast isolation and culture in potato, the division frequency of protoplast derived cells was significantly higher than that using the leaves and shoot-tips of the test-tube plantlets: the yield and quality of the protoplast from TPSs cultured under continuous high light intensity (3000 Ix) were much higher than the TPSs cultured under low light intensity (1000 Ix), and no intact protoplast was ever obtained from the TPSs cultured in continuous dark condition. Vacuum infiltration of the cotyledon and hypocotyl segments in enzyme solution before digestion increased protoplast yield. The yield of protoplasts from hypocotyl tissue was significantly higher than from the cotyledon, but there was no significant difference in quality between the protoplast derived from the two tissues. The significance, advantages and shortcomings of using the cotyledons and hypocotyls as the donor tissues for isolation and culture of potato protoplasts are dicussed.     

秦岭链霉菌的原生质体再生与诱变育种

在秦岭链霉菌(Streptomyces qinlingensis sp.nov.)的菌种改良中,应用原生质体再生并结合物理化学诱变能够得到产量较高、稳定性较好的菌株.筛选实验表明:秦岭链霉菌原生质体再生菌株R-72、诱变菌株NTG-1和H30-7对枯草芽孢杆菌的抗菌活性均提高了20%以上,并且连续培养10代,其遗传性状均比较稳定.进一步的生测实验表明菌株R-72,NTG-1和H30-7对5种病原细菌和5种植物病原真菌的抗菌活性相比原始菌株有显著提高.     

秦岭链霉菌的原生质体再生与诱变育种

在秦岭链霉菌(Streptomyces qinlingensis sp. nov.)的菌种改良中, 应用原生质体再生并结合物理化学诱变能够得到产量较高、稳定性较好的菌株。筛选实验表明：秦岭链霉菌原生质体再生菌株R-72、诱变菌株NTG-1和H30-7对枯草芽孢杆菌的抗菌活性均提高了20%以上, 并且连续培养10代, 其遗传性状均比较稳定。进一步的生测实验表明菌株R-72、NTG-1和H30-7对5种病原细菌和5种植物病原真菌的抗菌活性相比原始菌株有显著提高。     

茯苓原生质体制备与再生条件的研究

研究了酶、酶解时间、菌龄、稳渗剂等对茯苓原生质体制备与再生的影响。茯苓原生质体制备的最佳条件为:纤维素酶(1．5%)和蜗牛酶(1．5%)的等量混合酶解系统,酶解时间3h,7d菌龄菌丝,产量可达1．77×10~7个/mL。以甘露醇为稳渗剂,采用CYM再生培养基,酶解时间3h,7d菌龄菌丝,其原生质体再生率最高,为0．164%。这一结果为茯苓通过原生质体技术进行菌种改良提供了重要技术参数。     

地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

目的：提高地衣芽孢杆菌原生质体的产量和形成率,为进一步提高原生质体转化率打下基础。方法：通过酶解法对地衣芽孢杆菌工业生产菌株Bacillus licheniformis303原生质体的制备及再生条件进行了研究。考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对地衣芽孢杆菌原生质体的制备及再生的影响。结果：对数生长后期的菌体,以SMMP作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度为100mg/mL,37℃下酶解30min,原生质体生成量可达8×109个/mL;再生培养基选用含1mol/L琥珀酸钠的DM3时,再生率最高可达17%。在此条件下,采用PEG法将游离型质粒pHY-P43-secQ转化宿主菌B.lichenifor-mis303,转化率可达10~15 CFU/μg DNA。     

Efficient protoplast regeneration ofBacillus thuringiensis andAgrobacterium tumefaciens

Summary Treatment ofBacillus thuringiensis andAgrobacterium tumefaciens taken from the early growth phase (8 h) with lysozyme at 1 mg/ml gave 90–99% protoplast formation and 10–12% protoplast regeneration on the minimal medium in absence of plasma expander (Bovine serum albumin). Enhanced fusion frequency was obtained when protoplasts from 8 h grown cells were used for fusion experiments.