深圳大鹏湾海域锥状斯氏藻赤潮期间细菌群落结构变化研究

目的:近年来,赤潮在我国的发生呈增加的趋势,并造成了极大的经济损失。过去研究赤潮发生的机理主要集中在理化因素的影响,而越来越多的证据表明仅凭借营养盐等环境因素并不能解释大部分赤潮现象,藻际微生物可能发挥着重要作用。本文跟踪观测了2010年7月深圳大鹏湾海域爆发的锥状斯氏藻赤潮生消过程中细菌群落丰度种类的变化,从微生物与赤潮藻相互作用的角度探讨了赤潮的生消过程,讨论了不同时期不同关键菌群的特殊作用,为解释赤潮爆发和消亡提供了新的视角,为赤潮的监控和防治新方法的建立奠定了理论基础。方法:本文按时间顺序共采集该赤潮9次样本,利用末端限制性酶切片段长度多态性分析(T-RFLP)等分子生物学方法,通过主成分分析、克隆文库的构建,研究了微生物群落的变化过程,并探讨了特定种属的微生物在赤潮发生、发展和消亡过程中的作用。结果:从浮游细菌丰度来看,随着锥状斯氏藻细胞数量的波动,浮游细菌总数也随之呈现相应的变化。从浮游细菌的种类来看,它们主要属于变形杆菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。从浮游细菌的动态变化过程来看,赤潮生消过程中,浮游细菌群落呈现出一定的演替现象,特别是在赤潮后期,群落主成分变化尤为显著。从关键菌群的作用来看,属于γ变形杆菌门的Alteromonas sp.一直占有较高的丰度,赤潮中后期受到菌群相互作用导致比例下降,而赤潮后期其他关键菌群的丰度的增高可能是导致赤潮消亡的重要原因。结论:本文利用T-RFLP这一DNA指纹技术分析微生物群落结构和多样性特征,通过研究赤潮生消过程中藻际浮游细菌群落的动态变化,发现随着赤潮的发展,浮游细菌群落发生着相应的变化。结果说明赤潮藻体丰度数量的改变影响着浮游细菌群落的组成。相对地,细菌群落的适应调整迅速造成赤潮藻体局部生长环境的改变,从而影响赤潮的发展过程。     

锥状斯氏藻藻华期间群体感应信号菌株的动态变化

群体感应信号(quorum sensing, QS)是细菌的一种特殊交流方式, 它具有调节种群密度、生物膜形成、毒素产生以及色素的形成等多种功能。藻菌关系是藻华过程中重要的一环, 为了探求藻华过程中信号微生物的动态变化, 我们以深圳大鹏湾的锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)藻华中的QS 菌株为研究对象, 应用报告菌株和环境微生物宏基因组方法, 监测了藻华爆发期间信号微生物的动态变化过程, 并构建了藻类、QS 微生物与其它微生物的相关性关系。结果表明:在筛选的QS 菌株中经去冗余和重复后成功鉴定了7 种不同的细菌, 分别是冷杆菌Psychrobacter cryohalolentis、普罗维登斯菌Providencia sneebia、假单胞菌Pseudomonas stutzeri、微小杆菌Exiguobacterium sp. AT1b、产酸克雷伯菌Klebsiellaoxytoca、球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus 和鲍氏不动杆菌Acinetobacter baumannii。相关性分析发现P.sneebia 的丰度与藻类数量变化呈正相关, 而L. sphaericus 和P. stutzeri 的丰度与藻类数量变化呈负相关, 其它QS 微生物中未见显著相关性。综合实验的结果来看, QS 微生物在藻际微生物的群体结构中扮演着一定的生态作用, 它帮助我们从一个新的视角了解藻华过程中QS 微生物的丰度变化和网络关系, 为认识藻菌关系提供了新的思路。     

氯氰菊酯对锥状斯氏藻的毒性效应

为了评估拟除虫菊酯农药对海洋生物以及海洋环境的毒性效应,研究了氯氰菊酯对锥状斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)的毒性效应及其对叶绿素a(Chl.a)、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量等生理生化指标的影响.结果表明,低浓度(≤10 μg·L-1)的氯氰菊酯对锥状斯氏藻生长具有明显的促进作用,而高于50μg·L-1则产生较明显的抑制效应.藻细胞所有生理生化指标在暴露初期的6～12 h较为敏感,24 h或48 h后趋于平稳;细胞内含物包括Chl.a、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD活性,在低浓度时均出现诱导现象,而高浓度时则呈现先抑制后恢复的现象.而氯氰菊酯对藻体内MDA含量均具有促进作用,浓度越高促进作用越强.研究结果表明,锥状斯氏藻的各种生化指标对氯氰菊酯的响应均较为敏感,但SOD和MDA对剂量反应更为敏感,最低影响剂量为5μg·L-1和1μg·L-1,可作为拟除虫菊酯农药污染早期预警的生物指示指标.     

氮磷限制对锥状斯氏藻孢囊形成的作用

在实验室研究了锥状斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)在N、P单因子营养限制(N:500μg.L-1,P:74～0.74μg.L-1和P:74μg.L-1,N:500～5μg.L-1)条件下的生长和孢囊形成。结果显示N、P限制不利于锥状斯氏藻的快速生长,其中低P对细胞生长的限制作用更显著。其孢囊形成率在15～99%之间,中度N限制能促进孢囊的形成,形成率几乎可达100%。孢囊一般在对数生长期结束、细胞数量达到最大值时开始形成。但由于接种后营养盐浓度的急剧降低,营养极度限制组孢囊可在接种后第1d就开始形成。结果显示稳定生长期孢囊的大量形成大大降低了锥状斯氏藻营养细胞数量,能在一定程度上促进其赤潮的消亡。     

海菖蒲浸提液对锥状斯氏藻的抑制效应研究

海菖蒲(Enhalus acodoides)是典型热带亚热带沿海常见大型海草, 但关于海菖蒲对赤潮藻的抑制作用研究少见报道。研究选取海菖蒲为实验材料, 利用人工海水和两种有机溶剂提取海菖蒲中抑藻活性物质并对锥状斯氏藻进行抑藻试验研究, 结果表明, 三种提取物对锥状斯氏藻均有显著抑制作用, 在试验设定浓度下, 水浸物在 2.5 g·L^–1 时具有最高抑藻率 95.34%, 乙醇提取物在浓度为 12.5 mg·L^–1 时即达到 78.55%, 正己烷提取物在浓度为 50 mg·L^–1 时最高抑制率达到58.28%。研究表明, 海菖蒲水提液抑制效果最好, 具有应用于近海水体富营养化的治理和开发新型抑藻剂的潜力。     

大亚湾海域锥状斯氏藻孢囊形成与萌发的季节变化

锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)是南海大亚湾海域优势甲藻。为了解该藻孢囊形成和萌发动态及其对营养细胞种群动态的影响,2001年1月-2002年1月在大亚湾澳头海域用沉积物捕捉器及TFO重力采泥器对其孢囊进行每月一次的周年监测,同时对浮游植物、水温、盐度、溶解氧等也进行了监测。孢囊形成和萌发分别以沉积物捕捉器中的孢囊形成率以及上表层沉积物中空孢囊的百分比来表示。钙质孢囊和非钙质孢囊年平均形成率分别为1.11×104 cysts m-2d-1和2.13×105 cysts m-2d-1。前者在冬季大量形成,而后者在夏季形成较多。孢囊多在春秋季节萌发,夏季萌发较少,而冬季几乎不萌发。在5月份和10月份营养细胞数量峰形成前,孢囊的萌发出现了高峰,而表层沉积物中的孢囊数量及孢囊形成率则在营养细胞数量峰后大幅度上升。由此可见,大亚湾沉积物中该藻孢囊的萌发给水体提供了丰富的营养细胞,反之水体中高密度营养细胞又促使孢囊的大量形成,从而造成了锥状斯氏藻赤潮在大亚湾海域接连发生。     

广东大亚湾甲藻孢囊及其与锥状斯氏藻赤潮的关系

1999年12月至2001年1月,在大亚湾澳头海域用沉积物捕捉器(Sediment trap)及TFO重力采泥器对甲藻孢囊进行每月一次的周年监测,并同时研究了浮游植物的季节变化.结果显示,晚秋孢囊形成率最高(3.48105 cysts/m2d),冬季形成率较低,年平均为1.28105 cysts/m2d.锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)是大亚湾沉积物孢囊中的绝对优势种,除个别季节外,其形成率一般占孢囊总形成率的50%以上.2000年8月至9月,该海域发生了一次较大规模的锥状斯氏藻赤潮,最高细胞密度达4.0104 cells/mL.赤潮中后期,锥状斯氏藻孢囊包括暂时性孢囊和休眠孢囊大量形成,孢囊的形成减少了水体中营养细胞数量,是赤潮消退原因之一.     

氮和磷浓度对中肋骨条藻和锥状斯氏藻种间竞争的影响

采用室内单养和混养方法, 设置不同的氮、磷营养条件, 研究了氮、磷对中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)种间竞争的影响。结果表明: 混养时各氮和磷浓度下均呈现培养初期中肋骨条藻为优势种、培养后期锥状斯氏藻为优势种的变化趋势, 但随着氮、磷浓度的升高, 中肋骨条藻作为优势种的时间延长; 与单养时相比, 混养中两种微藻的最大密度受到不同程度的抑制, 表现出氮、磷浓度越高, 受抑制的程度越大的特征, 且与锥状斯氏藻相比, 中肋骨条藻的最大密度受到抑制的程度更大。混养时两种微藻均是在氮、磷浓度最高时, 抑制起始点出现时间最长, 随着氮、磷浓度的降低, 抑制起始点出现时间缩短; 各氮、磷浓度条件下, 锥状斯氏藻对中肋骨条藻的竞争抑制参数明显高于中肋骨条藻对锥状斯氏藻的竞争抑制参数, 当氮浓度为512 μmol·L^-1、磷浓度为2 μmol·L ^-1时, 竞争结果是锥状斯氏藻获胜; 其余氮、磷浓度条件下为两种微藻不稳定共存。     

海洋卡盾藻与中肋骨条藻和锥状斯氏藻种间竞争研究

研究了不同起始细胞密度与硅酸盐浓度对海洋卡盾藻(Cm)与中肋骨条藻(Sc)及锥状斯氏藻(St)之间种间竞争的影响,利用竞争抑制参数对相互间的竞争关系进行了分析,并引入体积竞争抑制系数的概念。结果表明:海洋卡盾藻的环境容量不受起始细胞密度(100—3600cells/mL)的影响,但随着起始接种密度的增加,达到最大细胞密度和进入稳定生长期的时间均提前。在硅缺乏的条件下,中肋骨条藻仍能保持一定生长,并能在与海洋卡盾藻之间的种间竞争中保持数量优势,但硅酸盐浓度的增加有利于其种间竞争。初始细胞密度和接种比例对3种赤潮藻类之间的种间竞争影响明显,总体来说海洋卡盾藻在竞争中处于劣势。当海洋卡盾藻细胞密度远远高于中肋骨条藻时(Cm:Sc=6:1),海洋卡盾藻才能在与中肋骨条藻的竞争中取胜;而在与海洋卡盾藻共培养条件下,锥状斯氏藻具有一定竞争优势,其对海洋卡盾藻的体积抑制系数(α’)是后者(β’)的27—100倍。但在所有处理中均没有绝对优胜者,竞争结果都会出现不稳定的平衡状态。     

锥状施克里普藻孢囊的多种形态特征

休眠孢囊是某些甲藻生活史的重要阶段,它被认为是甲藻赤潮爆发的种源。通过观察我国沿海海域采集的锥状施克里普藻（Scrippsiella trochoidea（Stein）Loeblich）休眠孢囊的类型以及形态特征,并将实验条件下形成的休眠孢囊与海区沉积物中休眠孢囊的形态特征进行比较,结果表明,锥状施克里普藻细胞在20°C、12小时光照/12小时黑暗、f/2培养基和f/2-N培养基中分别培养至第14天和第8天,可以观察到休眠孢囊的产生。培养30天后,培养液中有大量休眠孢囊,将藻液避光保存90天后,观察到培养基中有4种类型的休眠孢囊产生：（1）球形到椭球形（长25-39μm）,钙质外壁,稀疏或密被钙质附属物（长1-4μm）;（2）球形（直径为29-35μm）,钙质外壁,附属物非钙质（长0.5-1.5μm）;（3）球形到椭球形（长29-35μm）,钙质,表面光滑,无附属物;（4）球形（直径24-35μm）,有机外壁,无附属物。第1种类型的孢囊最为常见,分别占到2种培养条件下所得全部孢囊的77.70%和95.18%。从沉积物中所得的孢囊多属于第1种类型。分析了实验条件下形成不同类型休眠孢囊的原因和比例,同时探讨了海区沉积物中形成多种孢囊形态特征的原因,为锥状施克里普藻孢囊的生态研究提供了依据。     

柄杆菌对固氮蓝藻生物量及色素的影响

柄杆菌对固氮蓝藻生物量和色素的影响研究结果表明:多态柄杆菌(Caulobacter polymorphus)017-41或新月柄杆菌(Caulobacter creseentus)CB_2的活菌、死菌及破碎细胞悬液分别与鱼腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostoc)不同藻珠混合培养时,试验组生长量均优于对照组;对衰老黄化的藻培养物的生长刺激作用尤为显著;试验组藻培养物的藻蓝或藻红素含量亦明显高于对照组。其作用机理尚待进一步阐明。     

利用Fv/Fm检测锥状施克里普藻 N和P限制的局限

通过测定缺N和缺P的锥状施克里普藻(Scrippsiella trochoidea)在分别添加充足的NO3-N、PO4-P后,光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学量子产量(Fv/Fm)的变化,来检验Fv/Fm能否用来检测锥状施克里普藻N、P限制的情况。实验表明,锥状施克里普藻分别在不加N、P元素的f/2-Si培养基培养过程中,缺N组叶绿素a(Chla)浓度先升高,在原培养液N耗尽后快速下降;缺P组Chla开始时升高,在原培养液P耗尽后缓慢下降。两组藻液Fv/Fm比值保持相对稳定,短时间内未见明显降低。当分别向藻液中重新添加充足的N和P后,缺N组藻液添加N后Chla浓度48h内明显上升,缺P组藻液添加P后Chla浓度48h内没有明显变化,两种培养液中Fv/Fm均未见明显升高。结果证明,利用Fv/Fm不能够快速检测锥状施克里普藻N、P限制的情况,该法在检测浮游植物营养盐胁迫时具有局限性。     

深圳湾表层沉积物中甲藻孢囊的垂直分布

采集了深圳湾3个采样点约20cm的表层沉积物样品,研究了甲藻孢囊的垂直分布。共分析鉴定出孢囊类型37种,其中5种为我国沿海未报道的新记录类型,原多甲藻类孢囊是该海域种类最丰富的孢囊类型。除上表层沉积物外,深圳湾甲藻孢囊密度较低,孢囊密度大多在500cysts／gDWt以下,总孢囊密度变化范围为83～4036cysts／gDWt之间。锥状斯氏藻是深圳湾甲藻孢囊的优势种类,上表层沉积物中该孢囊密度的急剧上升证实了2000年附近海域所发生的该藻赤潮。而裸甲藻类孢囊含量明显比南海其他海域高。孢囊的香农-威弗种类多样性指数为1．50～3．96之间,并且在非养殖区、离岸海域及较深层次沉积物中较高,而孢囊密度则呈相反的变化趋势。种类多样性的下降及孢囊密度的上升在一定程度上说明深圳湾污染的变化趋势,富营养化程度非养殖区大于养殖区,近岸海域大于离岸海域,并且近年来污染逐渐加剧。     

Sulfide pulsing as the controlling factor of spinae production in Chlorobium limicola strain UdG 6038

Chlorobium limicola UdG 6038, a green sulfur bacterium, was isolated from anoxic sediments. Cells were gram-negative, non-motile, ovoid shaped, and contained chlorobactene and bacteriochlorophyll c as the main photosynthetic pigments. The DNA G+C content was 56.4 mol%. Ultrastructural studies revealed the presence of abundant spinae (45–110 spinae per cell) attached to the cell wall. India-ink-stained cells observed under the optical microscope were surrounded by a large capsule (5–11 μm total diameter). The presence of this capsule was coincident with the presence of a large number of spinae (> 30 spinae per cell). The mucilaginous capsule was attached to the spinae without penetrating it. In batch culture, the synthesis of spinae in strain UdG 6038 was not affected by changes in temperature, pH, salt concentration, or illumination at physiological ranges and hence, the cells remained spined. The control of spinae production was experimentally confirmed using a semicontinuous batch culture refed by sulfide pulsing. The culture remained at a low spination level (> 30 spinae per cell) only when the duration of sulfide starvation between pulses was less than 5 h. After longer sulfide starvation periods, the cells remained spined (more than 38 ± 6.3 spinae per cell). This observation supports the idea that the duration of sulfide limitation in the culture plays a key role in controlling the spination process in strain C. limicola UdG 6038. Chlorobium spinae may play an eco-physiological role in buoyancy capacity and adhesion of sulfur globules to the cells in natural environments where sulfide concentrations are expected to be highly variable. Revision received: 13 November 1995 / Accepted: 19 January 1996