油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。     

一个新的家蚕LIMonly蛋白基因的序列分析和原核表达

LIM蛋白是一类含有LIM结构域的真核蛋白家族,它可介导细胞分化和发育,转录调控和激活、参与细胞骨架形成等多种重要的生物调节过程。从家蚕蛹cDNA文库获得一个新的编码LIM only蛋白的基因,我们将其命名为BmLIMO（BombyxmoriLIMonly protein）。该基因ORF长度为561 bp,编码长度为186个氨基酸残基的蛋白质,预测分子量为21.6 kDa,等电点为9.14。对BmLIMO基因进行了生物信息学方面的分析,并用DNA重组技术将Bm-LIMO片段克隆到原核表达载体pET-28α中,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了可溶性BmLIMO蛋白,这为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

油茶长链脂肪酰基CoA合成酶基因1(CoLACS1)分子特征与表达分析

长链脂肪酰基Co A合成酶(LACS)在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用。本研究以油茶(Camellia oleifera Abel)国家审定品种华硕(Camellia oleifera Huashuo)种仁转录组数据为基础,根据LACS基因Unigene序列设计引物,分离克隆了油茶LACS1基因全长c DNA序列,命名为CoLACS1(Gene Bank登录号:KJ960228),全长2114 bp,开放阅读框2088 bp,编码695个氨基酸;生物信息学分析显示CoLACS1具有3个B1ock,从分子特征可判断CoLACS1属于LACS家族;氨基酸同源比对显示与其他物种的LACS氨基酸序列具有较高的相似性,其中与拟南芥LACS7相似性为78%,与麻风树、大豆、毛果杨等物种LACS6(peroxisomal)相似性可达80%以上;对CoLACS1进行原核表达分析,构建的p ET30a-CoLACS1载体成功转化至BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达,菌液检测获得预测的目的蛋白(分子量约为76 k D);分析转录组数据中CoLACS1的Unigene序列RTKM值并对CoLACS1进行实时荧光定量PCR分析,结果表明CoLACS1在油茶华硕种子发育各时期平稳表达,表达丰度变化不大,荧光定量结果变化规律与转录组数据分析一致;同时分析华硕种仁不同时期含油率和脂肪酸成分变化,双变量统计分析发现CoLACS1表达模式与油茶油脂积累规律呈显著相关性。本研究为进一步研究油茶油脂积累与代谢的基因调控提供理论依据。     

四翅滨藜AcDHN基因的克隆及其抗逆功能分析

脱水素（dehydrin,DHN）是一类胚胎发育后期丰富蛋白（LEA）,在植物脱水条件下能保护细胞内蛋白质和膜结构免受破坏。本研究中,从四翅滨藜（Atriplex canescens）cDNA文库克隆得到逆境胁迫相关蛋白基因AcDHN的全长cDNA（登录号：JN974246）,并进行序列分析。将4cD鼢别插入到原核表达载体pET28a和双元表达载体pYES-DEST52中,通过转化大肠杆菌和酿酒酵母进行原核表达分析和真核表达分析。结果表明：AcDHN序列全长为1408bp,完整的开放阅读框长为1017bp,由338个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子量为38.3kDa,理论等电点为6．47,AcDHN与仙人掌中DHN蛋白同源性为55％。AcDHN基因在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达出分子质量约45．2kDa的融合蛋白。重组酵母菌株能表现出艮好抗逆性,特别是对NaCl、低温、Na2CO3和NaHCO3胁迫的抗逆性,其中抗碱胁迫能力表现最强。     

甘蓝型油菜水苏糖合成酶基因克隆及表达分析

以甘蓝型油菜品种‘德油5号’为试材,采用RT-PCR和RACE方法首次从油菜中获得水苏糖合成酶基因cDNA全长序列,命名为BnSTS,GenBank登录号为HQ285880.1。该cDNA全长3 210bp,包含一个长为2 619bp的开放阅读框,编码873个氨基酸。通过构建原核表达载体,成功表达出预期蛋白。同源性比对结果显示,该基因编码蛋白与拟南芥STS相似性最高为82.08%。荧光定量PCR结果显示,基因表达水平与油菜种子发育过程中水苏糖含量变化具有相关性,与种子脱水耐性的获得具有时间一致性。该基因可能在种子脱水耐性形成机制中具有一定的作用。     

烟实夜蛾脂肪酸结合蛋白基因的克隆、序列分析与表达

应用RT-PCR技术,从烟实夜蛾Helicoverpa assulta幼虫脂肪体组织和血细胞总RNA中反转录扩增脂肪酸结合蛋白(fatty-acid binding protein,FABP)基因的cDNA片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达并进行检测。结果表明：扩增得到的片段全长399 bp(GenBank登录号为DQ299942),编码132个氨基酸残基,预测分子量15.0 kD,等点电5.83。FABP融合了GST。原核表达后经电泳检测到约41 kD大小的外源蛋白,Western blot检测表明是目的蛋白。     

烟粉虱MED隐种气味结合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA克隆及原核表达

采用RT-PCR和RACE技术成功克隆烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA全长。BtabOBP2(Gen Bank登录号:AIS71883)和BtabOBP4(Gen Bank登录号:AIS71884)的cDNA序列全长分别为1107 bp和874 bp,完整开放阅读框(ORF)分别为744 bp和429 bp,分别编码247和142氨基酸,BtabOBP4有6个保守的半胱氨酸,属于典型OBP,而BtabOBP2除了具有典型OBP的6个半胱氨酸,增加了3个保守的半胱氨酸,属于Plus-C OBP。将得到的BtabOBP2和BtabOBP4重组到原核表达载体pET30a(+),转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导融合蛋白表达。采用亲和层析和凝胶过滤层析纯化融合蛋白,并进行Western blot分析。结果显示,BtabOBP2和BtabOBP4融合蛋白在大肠杆菌中均有可溶性表达,Western blot结果证实所表达的融合蛋白确实为目的蛋白。BtabOBP2融合蛋白在SDS-PAGE中的表观分子量比预测的分子量大了6.53 k Da,用重组肠激酶切掉6×His标签后,目的蛋白的表观分子量与预测分子量相近,偏差降低,说明6×His标签是造成融合蛋白表观分子量偏差的原因。本研究明确了烟粉虱气味结合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的核苷酸、氨基酸序列特征,并成功进行了原核表达和纯化,为进一步研究这两个OBP基因的分子结构和功能奠定了基础。     

千年桐SAD基因克隆与分析及其丝状真菌表达载体构建

以发育中的千年桐种子总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到硬脂酰脱饱和酶基因SAD的cDNA序列。该序列长度为1 191 bp,编码396个氨基酸。推测的分子量为45 541.01 u,等电点pI为6.05。BLAST分析表明,该cDNA序列与其它已登录的SAD基因cDNA序列一致性最高可达93.1%;编码的氨基酸蛋白序列性一致最高为89%。同时,构建了由构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的gpdA启动子驱动的丝状真菌表达载体,通过冻融法转入农杆菌中,PCR鉴定表明,pBAR-SAD已转入农杆菌EHA105中,成功构建了农杆菌工程菌株。     

与胡萝卜胚胎发生相关的胚性细胞蛋白63cDNA分离及其基因表达研究

以胡萝卜(Daucus carota L.)鱼雷形胚状体为材料,以λgt10噬菌体为载体,构建了一个含有6.0×10~8个重组子的cDNA文库。用PCR法扩增的长度为1.1kb的胚性细胞蛋白(ECP)63 DNA片段作探针,从cDNA文库中筛选出一个完整的ECP63 cDNA克隆。ECP63 cDNA核苷酸序列总长为1989bp,编码1个含569个氨基酸残基的蛋白质,分子量为62kD。以ECP63 cDNA全长作探针的Northern分子杂交结果表明,ECP63基因在胚性细胞和不同发育时期的胚状体中高度表达,但在幼苗和非胚性细胞中不表达。在转录水平上,ECP63基因在合子胚胎发生后期大量表达。