Vero及Vero-dst细胞对犬瘟热病毒敏感性比较

目的为了更好地分离犬瘟热病毒（CDV）并确诊犬瘟热,本实验比较了Vero及Vero-dst细胞对此病毒的敏感性。方法将CDV标准毒株Snyder Hill株及临床犬瘟热阳性犬组织匀浆分别接种Vero及Vero-dst两种细胞,通过观察细胞病变、检测病毒滴度（TCID50）,并通过RT-PCR法进行比较,分析两种细胞对CDV的敏感性。结果接种病毒后Vero细胞盲传5代始终未见细胞病变,而Vero-dst细胞12 h出现了明显的合胞样细胞病变,且RT-PCR扩增出了CDV基因特异性片段。结论 Vero-dst细胞对CDV表现了良好的敏感性,是体外分离培养CDV的一个有效细胞系。而所本实验中使用的Vero细胞并不适于CDV的分离与培养。另外,本实验利用Vero-dst细胞从临床犬瘟热阳性病例中成功分离到了野毒株,并确定其毒力较标准毒株毒力强,可用于进一步的研究。     

表达犬CD150的Vero细胞系的建立

目的建立表达CD150基因的非洲绿猴肾细胞系Vero-CD150,提高犬瘟热病毒的分离效率。方法分离健康犬血液中的白细胞,并克隆编码CD150的基因,构建真核表达质粒pIRES-CD150,将该质粒转染Vero细胞系,经过克隆化筛选获得Vero-CD150细胞系。利用RT-PCR、流式细胞仪（FCM）进行鉴定,同时对临床检测为阳性的自然发病犬,取肝、肺、脾脏等脏器为病料,接种于Vero-CD150细胞系。结果RT-PCR和流式细胞仪皆检测到CD150在Vero细胞中能够稳定表达;与Vero细胞系相比,Vero-CD150细胞系的生长特性相似;接种病料后,感染细胞不仅产生明显的细胞病变,且用RT-PCR可检测到病毒核酸。结论本试验使CD150基因能在体外转入正常的非洲绿猴肾细胞系Vero中,获得稳定表达CD150基因的Vero细胞亚克隆,并使后者结合CDV的能力明显增强。该细胞系的建立,为更有效的分离犬瘟热病毒打下了基础,可用于进一步研究。     

狐、貉和水貂犬瘟热病毒受体SLAM 的基因克隆及其真核表达

信号淋巴激活分子(SLAM)为犬瘟热病毒(CDV) 感染其宿主动物识别的细胞受体。本试验应用RT -PCR 从狐狸、貉和水貂的外周血淋巴细胞中克隆到其相应SLAM 基因。基因测序比较发现,狐狸、貉与同科的犬SLAM 基因编码区长度均为1 029 bp,核苷酸同源性高于98.6% ;而水貂SLAM 基因编码区长度为1 020 bp,与以上三种动物遗传关系较远(核苷酸同源性< 83.7%),但与海豹SLAM 基因遗传关系较近(核苷酸同源性为91.4% )。基于不同动物SLAM 基因序列的系统进化树分析显示,犬、狐狸、貉、水貂和海豹在进化树上构成了以CDV 为感染宿主的遗传分支。氨基酸序列比较显示,该5 种动物SLAM 分子上均存在一个长度为26 个氨基酸的信号肽序列,且在空间结构上影响宿主--病毒特异性的8 个关键氨基酸均完全保守。通过构建表达该狐狸、貉、水貂SLAM 基因的三种真核表达质粒,分别转染CRFK 细胞后,应用CDV 强毒感染试验证实,CDV 均能在三种转染细胞上产生明显的细胞病变效应(CPE),而未转染CRFK 细胞对照无CPE 产生,由此证实作为CDV细胞受体的狐、貉和水貂的SLAM,体外表达后能明显增强犬瘟热强毒株对非敏感细胞的感染能力。     

稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系的建立

旨为建立稳定表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P54蛋白的Vero细胞系,将ASFV-P54基因与绿色荧光基因Azami Green的融合基因片段,将其克隆至慢病毒载体pLV-puro中构建重组慢病毒质粒pLV-ASFV-P54-AG,将该质粒与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染HEK-293V细胞,包装表达ASFV-P54蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染Vero细胞,筛选出一株稳定表达ASFV-P54蛋白的Vero细胞系,命名为Vero-AG-ASFV-P54。间接免疫荧光试验表明,该细胞系能够与P54多克隆抗体反应;经波兰国家兽医研究所进一步验证,结果显示,该细胞系与ASFV抗体阳性血清也能发生反应,并且与阴性血清无反应。结果表明,Vero-AG-ASFV-P54细胞系能够稳定高效的表达具有生物活性的ASFV-P54蛋白。     

hTERT基因组成型过量表达的Vero细胞系的建立

目的:建立组成型过量表达hTERT的Vero细胞系。方法:从质粒pCI-neo-hTERT酶切、分离纯化hTERT cDNA,克隆入phEF/chMAR-hyg载体中,构建重组真核表达质粒phEF/chMAR-hyg-hTERT。采用脂质体转染法转染Vero细胞,经潮霉素筛选、克隆分离培养,用RT-PCR检测转染阳性细胞克隆的hTERT mRNA表达丰度,Western blotting验证高丰度表达hTERT mRNA克隆的hTERT表达。用Cedex AS20细胞密度和活力分析系统考察过量表达hTERT Vero细胞在组织培养板中批次培养的生长特性。结果:从phEF/chMAR-hyg-hTERT转染阳性细胞中筛选出hTERT mRNA和蛋白高丰度表达的Vero细胞系(Vero-T1),Vero-T细胞在批次培养中后期的细胞密度和活力均高于野生型Vero细胞。结论:成功建立了hTERT基因组成型过量表达的Vero细胞系,为探索以组成型过量表达hTERT的技术途径改善细胞培养特性、提高病毒疫苗生产工艺水平奠定了基础。     

表达登革病毒prM基因小干扰RNA的Vero细胞系的建立

prM蛋白是登革病毒膜蛋白M的前体,膜蛋白M对病毒的组装与成熟有重要作用,针对prM基因设计的小干扰RNA（siRNA）可短期抑制登革病毒复制.为了达到长期抑制登革病毒的效果,本研究构建了插入prM siRNA序列的重组慢病毒,利用流式细胞术分选以及杀稻瘟霉素抗性,筛选出稳定表达prM siRNA的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）系.经逆转录PCR及测序验证siRNA序列表达正确. Vero细胞中prM siRNA的表达率约为976%.当受到登革病毒攻击时,表达prM siRNA的Vero细胞能够明显抑制登革病毒prM基因的表达,并抑制登革病毒在Vero细胞中的复制.建立的Vero细胞系可用于RNA干扰防治登革病毒感染的进一步应用研究.     

犬瘟热病毒细胞膜受体的鉴定

犬瘟热病毒（ＣＤＶ）敏感细胞Ｖｅｒｏ用ＳＤＳ或ＲＩＰＡ溶解缓冲液溶解,利用病毒铺覆蛋白印迹技术（ＶＯＰＢＡ）鉴定犬瘟热病毒疫苗株（ＣＤＶ－ｏｎｄｅｓｔｅｐｏｏｒｔ）的细胞受体。结果发现,在Ｖｅｒｏ细胞上有两组ＣＤＶ结合蛋白质,即高分子量组蛋白质（１２７ｋＤ、１２０ｋＤ、１１０ｋＤ）与低分子量组蛋白质（２７ｋＤ和３０ｋＤ）。这些ＣＤＶ结合蛋白组分的性质及在ＣＤＶ致病中的作用有等进一步研究。     

犬瘟热病毒基因变异及其细胞受体研究进展

由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的犬瘟热(CD)一直是对世界养犬业、毛皮动物养殖业以及野生动物保护事业危害最为严重的传染病之一,甚至在广泛应用疫苗防制CD的近年,世界各地仍有犬或野生动物感染CDV并造成CD流行的报道.通过对CDV主要抗原基因--血凝基因(H基因)氨基酸序列分析,CDV可分为6个基因型.研究证实,CDV野毒株在抗原性上与疫苗株存在较大差异,因此推测H蛋白抗原变异造成了弱毒疫苗免疫效力的降低进而导致了某些地区CD的爆发.CDV作为一种宿主范围广泛的病毒,其细胞受体--信号淋巴细胞激活因子(SLAM)和硫酸乙酰肝素(HS)在哺乳动物体内的广泛存在是CDV跨物种间感染的重要因素.本文就国内外最新研究进展并结合作者的工作,对上述问题进行了综述和探讨.     

稳定表达β-synuclein的SH-SY5Y细胞株的构建

目的构建稳定表达β-synuclein的SH-SY5Y细胞株。方法利用脂质体转染技术将质粒pcD-NA3.1-β-synuclein转染SH-SY5Y细胞,通过Zeocin进行抗性筛选。采用原位免疫荧光、免疫组织化学染色及Western blot杂交检测β-synuclein在SH-SY5Y细胞中的表达情况;通过MTT比色法检测β-synuclein稳定表达对SH-SY5Y细胞增殖的影响。结果原位免疫荧光、免疫组织化学染色及Western blot检测结果显示β-synuclein在SH-SY5Y细胞中的表达水平较对照组明显升高;稳定表达β-synuclein的细胞增殖程度较对照组明显增高(P<0.05)。结论β-synuclein在SH-SY5Y细胞中稳定表达,为后续的研究提供有用的细胞模型。为进一步研究β-sy-nuclein对帕金森病发病神经保护作用的研究奠定了良好的基础。     

貂、狐、貉群犬瘟热临床及病理学研究

对2006年6～10月山东、河北等地区的部分毛皮动物养殖场发生疑似犬瘟热的疫情进行了流行病学、临床症状以及剖检病变观察和分析,对采集的病料进行了细菌分离鉴定、病毒特异性核酸检测,并选取肝、脾、肺、心、脑、膀胱和胃进行了病理组织学检查.结果表明,这起疫情主要是由携带CDV的貉、貂调运而促进病毒传播感染引起.发病动物剖检病变以全身脏器出血性变化为特征,病情及病变严重程度依次为貉＞狐狸＞水貂.病理学变化特征为肺泡壁增厚,大量炎性细胞浸润,且在脱落肺泡上皮细胞、膀胱上皮细胞胞浆内偶见嗜酸性的球形包涵体,支气管上皮变形、坏死、脱落,淋巴细胞浸润;非化脓性脱髓鞘性脑炎;脾脏、肾脏、心脏、肝脏、胃和肠道有不同程度出血、坏死等病变.通过对发病狐、貉、貂的肺、肝、脑、膀胱等脏器病理学比较,在病变程度上水貂与狐狸、貉有差异.但是同一种动物,依病程、病型及有无并发症等因素,病理学变化也存在差异.     

Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in Vero cells expressing canine SLAM (CD150) and their adaptability to marmoset B95a cells

We have previously shown that canine signaling lymphocyte activation molecule (SLAM; also known as CD150) acts as a cellular receptor for canine distemper virus (CDV). In this study, we established Vero cells stably expressing canine SLAM (Vero.DogSLAMtag cells). Viruses were isolated in Vero.DogSLAMtag cells one day after inoculation with spleen samples from five out of seven dogs with distemper. By contrast, virus isolation with reportedly sensitive marmoset B95a cells was only successful from three diseased animals at 7 to 10 days after inoculation, and no virus was recovered from any dogs when Vero cells were used for isolation. The CDV strain isolated in Vero.DogSLAMtag cells did not cause cytopathic effects in B95a and human SLAM-expressing Vero cells, whereas the strain isolated in B95a cells from the same dog did so in canine or human SLAM-expressing Vero cells as well as B95a cells. There were two amino acid differences in the hemagglutinin sequence between these strains. Cell fusion analysis after expression of envelope proteins and vesicular stomatitis virus pseudotype assay showed that their hemagglutinins were responsible for the difference in cell tropism between them. Site-directed mutagenesis indicated that glutamic acid to lysine substitution at position 530 of the hemagglutinin was required for the adaptation to the usage of marmoset SLAM. Our results indicate that Vero cells stably expressing canine SLAM are highly sensitive to CDV in clinical specimens and that only a single amino acid substitution in the hemagglutinin can allow the virus to adapt to marmoset SLAM.     

Establishment of a novel immortalized human prostatic epithelial cell line stably expressing androgen receptor and its application for the functional screening of androgen receptor modulators

In this study, we developed a human prostatic epithelial cell line BPH-1-AR stably expressing AR by lentiviral transduction. Characterization by immunoblot and RT-PCR showed that AR was stably expressed in all representative BPH-1-AR clones. Androgen treatment induced a secretory differentiation phenotype in BPH-1-AR cells but suppressed their cell proliferation. Treatments with AR agonists induced transactivation of a transfected PSA-gene promoter reporter in BPH-1-AR cells, whereas this transactivation was suppressed by an AR antagonist flutamide, indicating that the transduced AR in BPH-1-AR cells was functional. Finally, we utilized BPH-1-AR cells to evaluate the androgenic activities and growth effects of five newly developed non-steroidal compounds. Results showed that these compounds showed androgenic activities and growth-inhibitory effects on BPH-1-AR cells. Our results showed that BPH-1-AR cell line would be a valuable in vitro model for the study of androgen-regulated processes in prostatic epithelial cells and identification of compounds with AR-modulating activities.     

圈养狐貉源犬瘟热病毒地方分离株H基因的遗传变异分析

本研究于2004～2006年从人工饲养的发病狐貉中分离到6个CDV分离株,用RT-PCR方法扩增了其H蛋白基因片段,并对其进行了克隆和测序.测序结果表明,6个CDV分离株H基因阅读框全长均为1 824 bp,编码607个氨基酸,未发现碱基的插入和缺失.与Genbank中的34株CDV参考毒株的H基因序列进行比较和分析,现有的CDV毒株可以分为Asia-1、Asia-2、America-1、America-2、Europe和Arctic 6个基因型,本实验中的分离株HL为Arctic基因型,与来自意大利的194/97株、丹麦的Green株同分在一组,其余5株分离株与来自日本的HAMA、UENO、Tanu96等毒株以及来自中国的TN株、GP株(大熊猫株)分在一组同属Asia-1型,表现出一定的地理位置相关性;6个分离株均与Onderstepoor、Convac等疫苗株差异较大、关系较远,提示病毒变异可能是造成目前已免疫动物仍然发生犬瘟热流行的原因之一.     

稳定表达hHCN2基因 HEK293细胞系的建立

目的：培育稳定表达hHCN2基因的细胞系,建立一种表达研究心肌离子通道的有效模型。方法：通过脂质体转染的方法,将重组pcDNA3-hHCN2真核表达载体导入人胚肾细胞（HEK293细胞）,以G418压力筛选转染细胞,并对其进行全细胞膜片钳记录。结果：经600μg／ml压力筛选后,获得抗性细胞克隆,并用全细胞膜片钳技术记录到克隆hHCN2通道编码电流。结论：本实验采用脂质体转染法成功地培育出G418抗性HEK293细胞。为进一步研究克隆离子通道结构和功能的关系奠定基础。     

Establishment of a persistent mutant of canine distemper virus

We produced a B95a lymphoid cell line persistently infected with canine distemper virus (CDV), in which virus-specific antigens were present in nearly 100% of cells without causing cytopathic effect. The virus recovered from this cell line was able to infect fresh B95a cells persistently, indicating that a persistent CDV was established.