丙肝抗原决定簇与CTB的融合、表达及融合蛋白的纯化

通过固相化学合成法合成了编码丙型肝炎病毒(HCV)结构区和非结构区的4个抗原决定簇基因,这些抗原决定簇基因片段以不同方式串联后与ctxB基因融合,构建了12种表达不同嵌合蛋白的重组质粒,各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白,表达产量在10～50μg/ml之间,随所融合的抗原决定簇不同而不同,表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关,而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯化,达到了电泳纯,为进一步研究融合蛋白的抗原性及用作抗-HCV ELISA诊断试剂抗原打下了基础。     

丙型肝炎病毒抗原决定簇与霍乱毒素B亚基的融合表达以及融合蛋白的抗原性

通过固相化学合成法,合成了编码丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区和非结构区的４个抗原决定簇基因,这些抗原决定簇基因片段以不同方式串朕后与ｃｔｘＢ基因融合,构建了１２种表达不同嵌合蛋白的重组质粒。各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白,表达产量随所融合的抗原决定簇不同在１０～５０μｇ／ｍｌ之间,表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关,而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯化达到了电泳纯。对１１种融合蛋白中ＨＣＶ抗原决定簇的反应原性的研究表明,多数融合蛋白中ＨＣＶ抗原决定簇均能与对应的ＨＣＶ抗体结合。其中以融合蛋白９５０８２为抗原研制的抗－ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂具有良好的灵敏度和特异性。     

四价HCV聚合抗原的克隆,表达及在抗—HCV ELISA试剂中的应用

本研究通过反转录从丙肝病人血清中克隆了丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ３３ｃ基因,通过ＤＮＡ合成法又分别合成了编码ＨＣＶ核心抗原基因,ＮＳ４抗原及ＮＳ５抗原部分抗原决定簇的基因,利用基因工程手段,在大肠杆菌中表达了含有上述四种抗原的融合蛋白。该融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,以该融合蛋白为抗原制备的抗－ＨＣＶＥＬＩＳ试剂检测了中国药品生物制品检定所１９８份标准血清时,其阳性,阴性符合分别达９７％和９８％     

丙型肝炎病毒抗原决定簇与霍乱毒素B亚基的融合表达以及融合蛋白的抗…

通过固相化学合成法,合成了编码丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区和非结构区的４个抗原决定簇基因。这些抗原决定簇基因片段以不同方式串联后与ｃｔｘＢ基因融合,构建了１２种表达不同嵌合蛋白的重组质粒。各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白,表达产量随所融合的抗原簇不同在１０－５０μｇ／ｍｌ之间,表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关,而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯     

不同抗HCV ELISA试剂盒在献血员筛选中敏感性的比较

本研究比较了德国产阿克苏（ＡＫＺＯＮＯＢＬＥ）和国产科华抗ＨＣＶＥＬＩＳＡ诊断试剂盒用于献血员筛选的敏感性。使用ＡＫＺＯ试剂盒于青岛市中心血站１２４２例职业献血员中筛查出４４份阳性血清,再将该４４份阳性血清用国产科华试剂盒检测,结果仅有１８份呈阳性反应,其它２６份均呈阴性反应;１３份经ＡＫＺＯ检测为阴性的血清,科华试剂盒检测全部呈阴性反应。统计学处理两试剂盒敏感性具有极显著差异（Ｐ＜０．０１）。表明国产科华试剂盒敏感性低于ＡＫＺＯ试剂盒,有待于进一步改进和完善。     

献血员血清抗—HCV和HCV RNA检测

本文对宜昌市的２９９９名献血员,５９４名自然人群的血清进行了抗－ＨＣＶ、ＨＣＶＲＮＡ检测,结果表明,献血员中抗－ＨＣＶ阳性２３例,阳性率为０．７７％。其中宜昌、巴东分别为０．７３％和０．７６％,沙市为０．８３％。地区、性别、城乡之间抗－ＨＣＶ阳性率无显著性差异（ｐ＞０．０５）。参照以往文献报导,此阳性率比国内报导的低,与国际的相一致。５９４名自然人群抗－ＨＣＶ结果均为阴性,献血员与自然人群之间抗－ＨＣＶ阳性率差异显著（ｐ＜０．０５）。２０例抗－ＨＣＶ阳性者中检出ＨＣＶ　ＲＮＡ阳性６例,占３０％（６／２０）,占受检献血员的０．２０％（６／２９９９）,比武汉（０．８０％）低４倍,地区之间无显著差异（ｐ＞０．０５）。由此初步确认：宜昌市献血员中丙型病毒性肝炎感染低于国内某些大中城市、宜昌市（含七县二市）巴东县、沙市市是丙型病毒性肝炎低感染区。但存在无症状病毒血症携带者传染源。     

HCV感染者抗HCV抗体产生的不均匀性与B细胞优势克隆

本文采用抗原捕捉ＥＬＩＳＡ方法检测了ＨＣＶ感染者血清中抗－ＨＣＶＩｇＧ抗体轻链Κ和λ的比值,发现所检测的抗ＨＣＶ－ＮＳ４、抗ＨＣＶ－ＣＰ１和抗ＨＣＶ－ＣＰ２抗体轻链的表达呈现明显的偏斜,６５例抗ＨＣＶ阳性者中６３例（占９６．９％）,至少一种抗ＨＣＶ抗体К／λ偏离了正常１∶１的比值,尤以λ链较多,分别占６５．６％、８９．９％和７０．２％,但任何一个ＨＣＶ感染者血清抗－ＨＣＶ抗体既可能是Κ链占优势,也     

丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用

选取丙型肝炎病毒(HCV)核壳蛋白区两个可能含有优势抗原表位的19和16氨基酸的肽殴(C-19肽和C-16肽),利用固相多肽合成技术进行了化学合成。经用反相高压液相层析(HPLC)及脉冲液相多肽测序技术检定合成肽产品的纯度及序列后,以C-19和C-16肽作为包被抗原组装成检测HCV血清抗体的ELISA诊断试剂。用所组装的合成肽试剂检测中国药品生物制品检定所提供的HCV标准参比血清,并比较利用该试剂和美国Abbott实验室生产的HCV第二代EIA诊断试剂平行检测109份献血员血清的结果,表明C-19肽能够特异、重复、灵敏地检出HCV血清抗体,可以作为我国第一代HCV诊断试剂的合成肽抗原。     

丙型肝炎病毒CS,NS3 NS4区抗原融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

丙型肝炎病毒是与输血有关的非甲非乙肝病毒[1] ;是全世界输血后获得性肝炎的重要病因之一 ,并与急慢性肝炎、肝硬化和肝癌有关。由于主要通过输血的传播 ,会给人民的身体健康尤其输血事业带来极大危害。采用基因工程技术 ,表达含有多段抗原的融合蛋白作为ＨＣＶ检测试剂的抗原 ,可以简化多种抗原的表达及纯化过程 ,并提高了试剂的均一性[2 ] 。研究表明 ,在ＨＣＶ的抗原基因中 ,核心蛋白Ｃｏｒｅ、ＮＳ3区的Ｃ33ｃ抗原、ＮＳ4区基因编码的抗原免疫原性最强 ,相应抗体出现早 ,分布广 ,亲和力强。因此 ,我们构建了含有中国人ＨＣＶ序列的Ｃｏ…     

FLAG融合短肽在重组蛋白质纯化中的应用

FLAG融合标签由八个氨基酸组成(AspTyrLysAspAspAspAspLys),专门设计用于重组蛋白质的免疫吸附纯化。现已发展出了多个针对该短肽的抗体,包括M1、M2和M5单克隆抗体。FLAG标签与融合的重组蛋白质之间一般含有一个肠激酶切割位点,可以用肠激酶切割除去。FLAG融合标签技术具有简单、快速进行定量检测的优点,在重组蛋白质的分离纯化中应用广泛。     

小鼠仙台病毒ELISA抗体检测规范化试剂盒的研制与应用

目的按照实验动物国家标准和农业部对于兽医诊断制品的要求研制小鼠仙台病毒抗体检测试剂盒,并在临床检测中分析其适用性。方法建立仙台病毒的种子批和BHK-21细胞的细胞库;标化仙台病毒生产工艺、抗原蛋白纯化工艺;优化ELISA反应板体系;标化质控血清。使用规范化的ELISA试剂盒对我单位672份送检血清样品进行检测,使用IFA和Western blot方法进行复检。结果病毒的种子批检验表明在-80℃保存半年以上毒力稳定;病毒生产和抗原纯化工艺的标准化提高了抗原生产的稳定性;对照体系的设定降低了环境等变量对于结果判定的影响。在对临床样本的检测过程中发现3种方法的灵敏度ELISA高于Western blot高于IFA。结论规范化的小鼠仙台病毒ELISA抗体检测试剂盒能对小鼠仙台病毒感染状况作出准确判断,具有一定的稳定性和结果可重复性。     

检测HSA—GLP-1融合蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立

目的：为检测血清中HSA-GLP-1融合蛋白整体分子的浓度,建立一种特异、灵敏的定量检测食蟹猴体内HSA-GLP-1融合蛋白浓度的双抗体夹心ELISA的方法。方法：采用双抗体夹心ELISA方法,以GLP-1单克隆抗体为包被抗体、HSA-GLP-1融合蛋白为夹心抗原、anti-HSA-Biotin为检测抗体,用Streptavidin-HRP进行免疫放大,TMB显色。结果：建立了检测HSA-GLP-1融合蛋白的ELISA方法,其线性范围为15.6~1000 ng/mL,最低检测限为15.6 ng/mL,与GLP-1、HSA、IL2-HSA均无交叉反应,板内和板间精密度均小于15%,准确度为±15%,冻融稳定性和稀释稳定性良好。结论：建立的HSA-GLP-1蛋白检测方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于HSA-GLP-1融合蛋白在临床前药代动力学试验的定量检测。     

重组土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA的融合表达及抗原性分析

目的:探索一种大量表达功能性土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA的方法。方法:采用SignalP 3.0 Server进行信号肽预测,将土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA信号肽的基因序列(75bp)去除,将1107bp的核心序列克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。结果:构建了pET32a-fopA载体,重组蛋白FopA表达量约占菌体总蛋白量60%,Western blot分析显示重组FopA蛋白有较好的抗原性。结论:获得了高效表达FopA的pET32a-fopA表达载体,为下一步土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA应用研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌内的表达及应用

将从中国丙肝病人血清中扩增克隆的丙型肝炎病毒核心蛋白基因（４０８ｂｐ）酶切处理后插入表达载体ｐＪＬＡ５０２内,获得高表达核心蛋白的重组工程菌。将重组菌经４２℃热诱导５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,表达的核心蛋白占菌体蛋白总量的２０％。经分子筛和吸附层析纯化后获得的核心蛋白,ＥＬＩＳＡ检测证实有较好的抗原性和特异性。用表达的核心抗原加用表达的ＮＳ＿３抗原（Ｃ＿３３）装配的抗－ＨＣＶ试剂盒,经用标准血清验证及与国外第二代抗－ＨＣＶ试剂盒比较,证实符合丙肝诊断试剂要求。     

LCMV重组蛋白抗原应用研究

目的用重组蛋白抗原取代淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原用于实验动物感染LCMV检测.方法合成LCMVsRNA第1816～2178位核苷酸序列编码的Np第380～500位氨基酸基因,克隆在Hisx6-GSTpET-28a载体中,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,建立ELISA检测试剂.结果合成基因表达产物经Ni-NTA-Agarose纯化后纯度达到95%以上.ELISA检测小鼠、地鼠和豚鼠结果与全病毒抗原基本一致,而且特异性较强,操作简便.结论用合成基因表达产物取代LCMV抗原检测病毒抗体,不仅可以消除病毒传播可能,而且特异性强.为实验动物及生物材料质量控制提供安全有效方法.     

凋亡素融合蛋白的可溶性表达及活性分析

目的:构建PET-28a-SPA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现其高效可溶性表达,测定对肿瘤细胞的凋亡效果。方法:本实验在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-28a-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western blot检测,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制。结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,软件分析表明表达蛋白占菌体蛋白20%左右。上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合,并且对A549肺癌细胞及Hela细胞具有一定的凋亡作用。结论:所获凋亡蛋白以高效胞质可溶形式表达,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

HEV ORF2重组菌菌种的稳定性及融合蛋白的应用

对HEVORF2 (HumanHepatitisEopenreadingframe)重组菌菌种进行稳定性研究并将其表达的融合蛋白用于酶标试剂。将重组菌种传 10 0代次 ,每隔 10代取样检测蛋白表达、质粒性状、遗传稳定性、染色特性、菌落形态及电镜检查。将其表达的融合蛋白经层析纯化用于酶标试剂中。经传代的各代菌体与菌种多项指标差异不显著 ,酶标试剂有敏感度及特异性 ,此菌种可作为表达融合蛋白ORF2 组装酶标试剂而长期使用。     

猪瘟兔化弱毒株E2基因的原核表达及间接ELISA的初步建立

猪瘟病毒E2蛋白C端含有一段30多个疏水性氨基酸组成的跨膜区域(Transmembrane region,TMR),用RT-PCR和巢式PCR分别扩增了含不同长度TMR的猪瘟兔化弱毒E2基因,并克隆入pGEX-4T-1的MCS中,构建了原核表达载体pGEXTE2-339(无TMR)、pGEXTE2-355(1TMR)、pGEXTE2-375(3TMR).因E2基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,选择了BL21-CodonPlus(DE3)-RP作为表达受体菌,结果表明pGEXTE2-339、pGEXTE2-355以包涵体的形式正确表达了目的蛋白,而pGEXTE2-375没有明显表达.并利用pGEXTE2-339、pGEXTE2-355表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA方法.     

猪瘟兔化弱毒株E2基因的原核表达及间接ELISA的初步建立

猪瘟病毒E2蛋白C端含有一段30多个疏水性氨基酸组成的跨膜区域(Transmembraneregion,TMR),用RTPCR和巢式PCR分别扩增了含不同长度TMR的猪瘟兔化弱毒E2基因,并克隆入pGEX4T1的MCS中,构建了原核表达载体pGEXTE2339(无TMR)、pGEXTE2355(1TMR)、pGEXTE2375(3TMR)。因E2基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,选择了BL21CodonPlus(DE3)RP作为表达受体菌,结果表明pGEXTE2339、pGEXTE2355以包涵体的形式正确表达了目的蛋白,而pGEXTE2375没有明显表达。并利用pGEXTE2339、pGEXTE2355表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA方法。