人牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的cDNA克隆、基因定位及组织表达谱分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)在真核生物中主要参与对包括Rho/Rac,Rap和Rab家族在内的多种蛋白质的翻译后修饰及细胞凋亡的调控.牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)是合成GGPP的关键酶,它催化法呢基焦磷酸与异戊烯焦磷酸的缩合反应而产生GGPP.报道了从人睾丸cDNA文库中克隆到一个与果蝇GGPPS cDNA高度同源的基因转录本,它的序列长1466 bp,其中nt 239～1138是一个完整的可读框,编码一个由300个氨基酸组成的35 ku蛋白质.该推导蛋白质的氨基酸序列与果蝇GGPPS的一致性和相似性分别达到了57.5%和75%,并且含有异戊二烯转移酶中保守的5个特征性结构域.Northern杂交结果显示人GGPPS基因在心脏中表达最高,在脾、睾丸、脑、胎盘、肺、肝、骨胳肌、肾、胰腺组织中为中度表达,而在其他组织中未见有明显的杂交带.采用辐射杂种细胞系定位技术,发现GGPPS位于人染色体lq43区.由于此前有遗传连锁资料证实该区域存在一个前列腺癌的易感位点,并且另有研究发现GGPP的结构类似物可抑制PC-3前列腺癌细胞系中p21rap蛋白的牻牛儿基牻牛儿基化,从而提示GGPPS有可能是与该病相关的候选基因之一.     

ggpps 5'-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的:研究牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs)基因启动子的活性;方法:从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5'-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果:本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5'-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论:ggpps基因的5'-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5'-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础.     

竹叶花椒ZaGGPPS基因克隆与表达分析

为了揭示竹叶花椒萜类代谢的分子机理及嫁接对其风味的影响,该文依据转录组数据设计特异性引物,采用RT-PCR方法从竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)中克隆得到一个全新的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)基因的全长cDNA序列,命名为ZaGGPPS,并利用NCBI、ProParam、SignalP 4.1 server、DNAMAN和MEGA 7.0软件对ZaGGPPS基因进行生物信息学分析,并比较其在嫁接树和实生树中的表达量。结果表明:ZaGGPPS包含完整的cDNA开放阅读框(OFR),由1 086 bp组成,编码361个氨基酸。其蛋白的相对分子量为39 079.14 Da,理论等电点pI为6.38。Blast比对结果显示该蛋白质属于GGPPS家族蛋白,含有2个GGPPS蛋白特有的天冬氨酸富集基序,分别是"DDXXXXD"和"DDXXD",以及5个特征性功能结构域。系统进化树结果显示竹叶花椒与芸香科植物甜橙(Citrus sinensis)、克里曼丁桔(C. clementina)、柚子(C. maxima)等亲缘关系较近。荧光定量PCR检测显示,ZaGGPPS基因在竹叶花椒中的表达量从高到低分别为实生树的叶、嫁接树的叶、实生树的茎、嫁接树的茎。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶是竹叶花椒萜类化合物生物合成途径中的关键酶,通过嫁接可影响ZaGGPPS基因在叶和茎中的表达量。该文对竹叶花椒ZaGGPPS基因进行了克隆与分析,为后续深入研究竹叶花椒香气形成的分子机理及利用分子生物学手段选育优良品种提供理论依据。     

ggpps 5′-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的：研究栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs）基因启动子的活性;方法：从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5′-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果：本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5′-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论：ggpps基因的5′-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5′-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础。     

高等植物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的研究进展

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)在植物体内催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的合成,GGPP是萜类物质、类胡萝卜素、叶绿素及几个重要植物激素合成的前体物,是联系植物体内多条重要次生代谢通路的节点物质。本文综述了植物GGPPS基因近年来的生物学功能研究进展和该基因家族的遗传分类情况,以及GGPPS小亚基基因的重要调控作用,拟为深入研究植物GGPPS基因的生物学功能和萜类含量调控的遗传工程提供新认识和新思路。     

茶树CsGGDPS7基因的克隆和表达分析

从茶树基因组鉴定得到牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS7,以铁观音茶树为材料克隆获得全长cDNA(GenBank登录号MH891780)。CsGGDPS7序列全长1 185bp,包含1 098bp开放阅读框(ORF),编码365个氨基酸。预测结果显示在N端包含叶绿体转运肽,亚细胞定位于叶绿体中。氨基酸序列分析结果显示,具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域(DDXXXXD和DDXXD)。进化树结果表明与油橄榄(Olea europaea)OeGGDPS7亲缘关系最近。荧光定量检测显示,CsGGDPS7在叶片中的表达量显著高于其他组织,但花发育阶段CsGGDPS7表达量差异不显著。在乌龙茶做青过程中,CsGGDPS7在晒青阶段就快速上调表达并在三摇达到峰值。CsGGDPS1和CsGGDPS2表达也受做青调控,但CsGGDPS4不受做青调控。研究推测,CsGGDPS7可能与乌龙茶萜类香气物质合成密切相关。     

香樟GGPPS基因的克隆及生物信息学分析

本研究目的是克隆香樟牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranyl-geranyl pyrophosphate synthetase,GGPPS)的c DNA序列,并进行生物信息学分析,为香樟萜类物质的生物合成及调控机制研究提供基础。根据香樟叶的转录组测序数据,设计特异性PCR引物,应用反转录RT-PCR方法,克隆获得香樟GGPPS基因,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析。结果显示,GGPPS基因包含全长1 152 bp的开放读码框(ORF),编码383个氨基酸,蛋白分子量为41.41 k D,等电点p I为5.84,是一个定位于叶绿体,不含跨膜结构域,不含信号肽的不稳定疏水蛋白。GGPPS氨基酸序列的主要二级结构为α-螺旋并含有一个类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域。通过氨基酸序列的同源性分析发现,香樟的GGPPS氨基酸序列与苹果、陆地棉和紫苜蓿等植物的GGPPS氨基酸序列有较高的同源性。分子进化树分析结果表明,香樟树GGPPS蛋白与无油樟GGPPS蛋白的亲缘关系相对较近。本研究成功克隆、分析并表达了香樟GGPPS,为进一步研究香樟GGPPS基因的功能,萜类合成调控机制等奠定了分子基础。     

丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞二萜类物质合成的重要调节靶点。本研究从药用植物丹参中克隆了一条新的GGPPS基因(SmGGPPS3),基因全长2908 bp,包含一个931 bp的内含子和一个960 bp的编码序列。推测的氨基酸序列与蓖麻、橡胶、拟南芥等植物GGPPS一致性达到67%以上。实时定量PCR结果显示,SmGGPPS3基因在丹参不同发育时期不同器官中表达差异显著,同时受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导。遗传互补实验也表明,SmGGPPS3编码蛋白具有GGPP合酶的活性。     

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的：利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因（SmGGPS1）RNA干扰（RNAi）载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法：根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）中,构建2个含卡那霉素（Kan）和绿色荧光蛋白（GFP）双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果：分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论：首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。     

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰盖鬼伞中的组合表达

紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。