超高分辨率显微技术研究进展

光学显微成像具有极为悠久的历史,但一直以来,光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。近年来,超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20 nm以下。值得庆贺的是,德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。在这篇文章中,我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用,并带领读者一同寻访大师的科学足迹。     

运用结构光照明的活细胞超高分辨率成像技术

<正>进入21世纪以来出现了多种超高分辨率荧光成像技术,打破了光学分辨率的极限,将光学分辨率提高到几十纳米的尺度,可以用来观察精细的细胞内器官的结构和位置信息,因此被广泛地应用于生物学研究中.超高分辨率荧光成像技术主要分为三大类,基于受激发射光淬灭(stimulated emission depletion,STED)技术,基于单分子开关的超高分辨率定位技术(包括光激活定位显微成像术     

超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究

超高分辨率显微镜是近年来生命科学领域重要的研究手段之一。2014年诺贝尔化学奖颁发给超高分辨率显微技术领域的三位科学家,以表彰他们在该领域所作出的杰出贡献。超高分辨率技术的典型代表有受激损耗、结构光照明以及单分子定位等。这些技术的出现使得传统光学显微镜难以分辨的细胞器、分子等细节信息可以被观察到,帮助科学家从纳米尺度认识细胞内分子结构、定位以及相互作用。     

几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展

在生命科学领域,人们常常需要在细胞内精确定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系．多年来,宽场/共聚焦荧光显微镜的分辨率受限于光的阿贝/瑞利极限,不能分辨出200 nm以下的结构．近年来,随着新的荧光探针和成像理论的出现,研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法．主要介绍这些方法的原理、近期进展和发展趋势．介绍了光源的点扩散函数(point spread function, PSF)的概念和传统分辨率的定义,阐述了提高xy平面分辨率的方法．通过介绍单分子荧光成像技术,引入了单分子成像定位精度的概念,介绍了基于单分子成像的超分辨率显微成像方法,包括光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和随机光学重构显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)．介绍了两大类通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法,分别是受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion, STED)和饱和结构照明显微技术(saturated structure illumination microscopy, SSIM)．比较了不同的z轴提取信息的方法,并阐述了这些方法与xy平面上的超分辨率显微成像技术相结合所得到的各种三维超分辨率显微成像技术的优劣．探讨了目前超分辨率显微成像的发展极限和方向．     

光片显微成像在斑马鱼模型中的生命科学研究的最新进展

光片显微成像是一种新兴的影像技术。相比于其他光学成像技术,光片显微成像技术具有成像深度大、对比度高、成像速度快、低光漂白和光毒性、高时空分辨率等特性。这些优点都是生命科学研究所急需的。近几年,研究者应用光片显微成像技术在斑马鱼模型基础上取得了很多进展。本综述主要介绍了光片显微成像技术在胚胎生物学和神经科学方面相关的研究成果。     

3D-SIM结构照明超分辨率显微镜实现蛋白质在植物亚细胞器内的定位

基因表达产物蛋白质的亚细胞定位是解析基因生物学功能的重要证据之一。近年来出现的超分辨率光学成像技术已成功应用于人类和动物细胞中,预示着显微成像技术继激光共聚焦技术后的又一重要进步。由于植物细胞的特殊性和成像技术的研发取向,超分辨率光学成像技术在植物细胞蛋白质亚细胞定位的应用尚未见报道。该研究利用Delta Vision OMX显微镜技术,克服了叶绿体基粒中叶绿素自发荧光与融合蛋白荧光不易区分的缺陷,解决了受分辨率局限无法将植物细胞中蛋白质在亚细胞器内可视化精确定位的技术难题,成功地将植物蔗糖合成酶Zm SUS-SH1定位在烟草表皮细胞叶绿体基粒周围。该研究同时建立了一套基于撕片制片法的简便OMX显微镜制片方法,并针对OMX显微成像技术在植物细胞中蛋白质亚细胞定位的应用进行了讨论。     

近场扫描光学成像结合量子点标记的纳米技术在细胞生物学中的应用

近场扫描光学显微镜（NSOM）对传统的光学分辨极限产生了革命性的突破,可在超高光学分辨率下无侵人性和无破坏性地对生物样品进行观测。量子点（QDs）具有极好的光学性能,如荧光寿命长、激发谱宽、生物相容性强、光稳定性好等优点,适合先进的生物成像。NSOM结合QDs标记的纳米技术被应用在细胞生物学中。通过纳米量级NSOM免疫荧光成像（50nm）对特定蛋白分子在细胞表面的动态分布进行可视化研究和数量化分析,阐明了蛋白分子在不同细胞过程中的作用机制。因此,NSOM／QD基成像系统提供了单个蛋白分子最高分辨率的荧光图像,为可视化研究蛋白分子机制的提供了一种强有力的工具。     

激光共聚焦显微技术在瓮安生物群中的应用

激光共聚焦显微技术是一种以激光作为激发光源,通过特殊装置"针孔"来过滤离焦光线以提高光学分辨率和对比度的光学成像技术。由于大部分化石不能自发荧光,该技术在古生物学领域尚未实现大范围的应用。但若围岩能自发荧光而与化石之间具有一定衬度,或化石因含特殊成分能在特定波段激光照射下自发荧光而产生结构衬度,则可以运用激光共聚焦显微技术获得在普通光学显微镜及荧光显微镜下难以清晰观察到的信息。为推动激光共聚焦技术在古生物学领域中的应用,文中系统介绍了该技术的原理与使用方法,并以埃迪卡拉纪磷酸盐化特异埋藏的瓮安生物群微体化石为例,展示了该技术在化石成像中的若干优势。实验结果表明,瓮安生物群微体化石因富含磷灰石可自发荧光实现成像,使用激光共聚焦显微成像技术观察瓮安生物群化石薄片不仅可以获得较好衬度,而且还能提高成像的分辨率和清晰度。此外,在化石薄片的厚度范围内还可以实现化石结构三维重建。     

三维X射线显微技术与小型-微体化石高分辨率无损成像*

在古生物学研究中,以X射线断层成像(Computed Tomography)为代表的三维无损成像技术可以在不破坏化石标本的前提下,同时获得标本外观形态和内部结构的信息,相比传统的可见光成像手段有着明显优势。为推动化石三维无损成像技术在国内古生物学领域的发展,本文系统介绍一种新型显微CT技术——三维X射线显微术(Three-Dimensional X-ray Microscopy)。与基于几何放大和吸收衬度成像的传统显微CT技术相比,该技术有若干优势:(1)将同步辐射X射线显微断层成像的光学成像系统引入基于实验室X射线源的显微CT系统中,在几何放大的基础上增加了光学放大,优化了传统显微CT的系统架构,弥补了传统显微CT单纯依靠几何放大的不足,提高了空间分辨率;(2)采用可移动的X射线源和优化的光学成像系统,实现了低能X射线相位衬度成像,可以三维重构传统显微CT技术无法有效探测的、低吸收衬度的化石标本;(3)基于新的成像架构和成像算法,实现了厘米-分米级较大标本内部"感兴趣区域"(Region of Interest)精确导航和局部高分辨率(微米-亚微米空间分辨)成像;(4)可以实现小型扁平标本(宽厚比4,宽10cm)高效率、高分辨率成像和长条形微体标本长轴方向自动分段无缝拼接的微米至亚微米级高分辨率重建,弥补了传统工业显微CT针对小型扁平标本和长条形微体标本高分辨成像效果不佳的缺陷。这些优势使得基于实验室X射线源的显微CT成像技术可以获得接近同步辐射X射线源的成像质量,从而有效推动化石生物学研究。     

用去卷积法提高超声调制光学成像的空间分辨率

超声调制光学成像的空间分辨率取决于光在组织中的散射程度和扫描超声束的聚焦大小。由于组织是强散射介质,实际应用中的超声束都有一定的聚焦宽度(通常是毫米数量级),所以该技术成像空间分辨率一直无法提高。针对这个问题,首次将去卷积图像处理法运用在超声调制光学成像技术中,有效地解决了扫描超声束带来的信号展开,分辨率下降的影响。理论和防真结果表明,处理后的成像分辨率大大提高,图像质量明显改善。该方法无须对系统装置做任何改动,只利用适当的数据处理,就实现了成像超分辨,具有应用价值。     

无透镜显微技术

无透镜显微成像(lens-free microscopy)是一种在不借助透镜的情况下进行成像的技术。它基于Gabor同轴全息原理,利用面阵探测器采集原始全息图,随后通过数字图像处理技术重建样本,从而实现数字显微成像。像素超分辨技术缩小了等效像素,提供更多细节信息使得再现像的分辨率得以直接提升,而且多种相位恢复手段通过去除孪生像也达到了间接提高分辨率的目的,尤其是对密集样本。无透镜显微成像技术突破了传统光学显微镜由透镜带来的空间带宽积的限制,实现了大视野范围下的高分辨率成像,因此,这一技术能够提供大视场下的临床样本快速诊断和准确检测。另外,新兴的算法和硬件都在不断地加快数据采集和计算速度,扩展了其在高速运动样本和纳米尺度样本上的应用。最近无透镜技术和其配套硬件设备发展方向趋向于硬件紧凑、算法密集、实时、三维、彩色、高分辨率的便携式分立器件或配件。     

PALM成像中激光强度和定位精度相关性的研究

近十年来,基于单分子定位的PALM成像技术快速发展,将显微镜的分辨率提高到了2-25nm。本文发现PALM成像过程中采用的激发光强度与成像的定位精度之间有密切的联系。我们分别选择了PALM成像使用的光激活荧光蛋白、光转换荧光蛋白和光开关荧光蛋白中最常用的荧光蛋白进行验证。实验发现伴随激光强度的增加,大部分荧光蛋白的光子数先升高然后趋于饱和,背景噪声几乎线性升高。进一步分析发现荧光蛋白的定位误差随着激光强度增强先降低后升高,因此选用合适的激光强度在PALM成像实验中至关重要。如何提高PALM成像的分辨率一直是科学家研究的热点,本研究内容可以指导研究人员在PALM成像中选用合适的激发光强度,从而得到高分辨率的图像。     

光学神经成像研究进展

大脑功能的成像检测在认知神经科学领域具有极其重要的意义。现代光子学技术的发展为认知脑成像提供了新的研究手段,在神经系统信息处理机制研究中发挥重要作用。文章介绍了在神经元、神经元网络、特定脑皮层功能构筑以及系统与行为等不同层次开展神经系统信息处理机制研究的各种光学成像技术,包括多光子激发荧光显微成像、内源信号光学成像、激光散斑成像和近红外光学成像等,并评述了这些有特色的光学成像技术在多层次获取和分析神经信息中的研究进展。     

二次谐波显微成像技术

二次谐波非线性显微成像技术是近年发展起来的一种新型光学成像方法,已广泛应用于生物医学的各个领域。介绍了光学二次谐波产生的原理、成像装置及其技术发展,描述了二次谐波的成像特点和它与双光子荧光成像的异同,并对其在生物医学上的应用及发展前景做出展望。     

基于三通道的超分辨率显微镜成像

显微技术经过快速发展，已经突破了光学衍射极限，目前主要包含受激发射损耗显微术（STED）、结构光照明显微镜（SIM）、光激活定位显微成像（PALM）、随机光学重构显微术（STORM）、基于最少光子数的纳米尺度定位（MINFLUX）、结合结构光照明技术的MINFLUX技术变体（SIMFLUX）等技术。STORM技术具有优越性，在其基础上叠加多色成像技术（目前有6种），本文介绍了目前最新的多色成像技术以及分光成像实现的三通道成像技术。分光成像实现的三通道成像存在光谱串色、通道对齐误差等影响，基于此介绍了相关的优化算法原理。展示了在三通道STORM显微成像平台上实现的COS-7细胞成像。说明三通道STORM显微成像的优越性。     

2014年诺贝尔化学奖

<正>瑞典皇家科学院决定将2014年诺贝尔化学奖授予Eric Betzig、Stefan W.Hell和William E.Moerner以表彰他们发明了超高分辨率荧光显微镜。超越光学显微镜极限——超高分辨率荧光显微镜的发展通过纳米显微镜(nanoscopy),科学家们可以在细胞中观察到单个分子的运动。他们可以看到活细胞中的单个分子。他们可以看到在脑的两个神经细胞之间如何产生突触;能够在导致帕金森病和亨廷顿舞蹈病的蛋白质聚集时观察它们;可以在受精     

受激发射损耗显微术(STED)的机理及进展研究

由于光学元件的衍射效应,常规光学显微术的分辨率被限制在半波长左右,无法满足对于亚百纳米尺度的样品进行探测的需求。受激发射损耗显微术(STED)通过引入一束损耗光以受激发射的方式减小有效荧光的发光面积,可以实现超衍射极限的空间分辨率。自提出以来,STED显微术经过了多方面的改进和发展,已被成功地应用于生物医学、材料学等领域,对样品进行多功能超分辨成像。本文详细阐述了STED的机理及其中的关键技术,综述了STED的发展历程及最新进展,并介绍了其具体应用。     

一体化的光声-荧光显微镜用于活体肿瘤成像

报道了一种利用单一波长激发的同时产生光声和荧光信号的显微成像系统,本成像系统具有超高的成像分辨率(<6μm)。借助外源的造影剂在近红外的吸收特性,利用光声-荧光显微成像系统对活体肿瘤进行光声/荧光成像。实验结果表明,光声-荧光显微镜在早期肿瘤的成像和检测等方面具有潜在的应用价值。因此,通过研究和选择适当的双模态造影剂,该系统在不同病理模型中可以提供更准确的组织信息及生理参数。     

综述: 光学显微水平全脑成像方法的研究进展

在全脑水平研究哺乳动物复杂的脑神经网络是现代脑科学的重要研究目标之一,但由于缺乏合适的研究方法,已有的研究还局限于高等动物的局部脑回路或低等动物的脑网络．为了实现大范围的高分辨三维成像,近10年来,发展出了一些光学显微成像新方法,已经或有希望应用于哺乳动物全脑的神经元网络成像研究中．本文对上述方法进行了归纳和比较,综述了各种成像技术在空间分辨率、探测范围、数据配准和成像速度等方面的性能表现及面临的挑战．     

基于受激发射损耗显微术的活细胞和活体超分辨成像

细胞作为生命体基本的结构和功能单元，在生物、医学等领域有着非常重要的研究意义。随着现代科学和技术的发展，科学家们借助电镜对细胞以及细胞器的空间结构已经有非常清晰的认识，但是对它们的功能以及细胞之间的相互作用却了解得非常少，而这恰恰又是疾病治疗和药物开发亟需了解的信息，因此对离体活细胞（简称活细胞）和活体生物组织细胞（简称活体细胞）中亚细胞器的研究变得非常重要。然而细胞中许多细胞器的结构在纳米量级，传统的光学成像技术由于受到光学衍射极限的限制是无法观察到纳米量级的生物结构，因此光学超分辨成像技术是目前研究亚细胞器结构和功能的有效工具。在所有光学超分辨显微技术中，受激发射损耗显微术（stimulated emission depletionmicroscopy,STED）由于具有实时成像、三维超分辨和断层成像的能力，非常适合用于纳米尺度的活细胞和活体细胞成像研究，而且STED超分辨成像技术经过近几十年的发展，已经广泛用于活细胞甚至活体小鼠细胞的超分辨动态观测。本文总结了近年来活细胞和活体小鼠神经元细胞等领域STED超分辨成像的研究进展，介绍了用于活细胞和活体细胞STED超分辨成像的荧光染料...