人参皂苷Rg1拮抗D-半乳糖致睾丸间质细胞雄激素分泌障碍的机制研究

该文重点探讨人参皂苷Rg1拮抗D-半乳糖(D-gal)致小鼠睾丸间质细胞分泌雄激素障碍的机制。采用D-gal构建小鼠衰老模型,体内注射Rg1干预衰老过程,观察睾丸组织细胞衰老的病理学改变;体外构建D-gal致睾丸间质细胞(TM3细胞株)衰老模型,在培养体系加入Rg1拮抗D-gal的致衰老作用。衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察小鼠睾丸组织细胞和体外培养TM3细胞的衰老情况;ELISA法检测TM3细胞分泌睾酮水平和细胞氧化应激损伤水平;荧光探针DCFH-DA检测细胞活性氧(ROS)水平;Western blot检测TM3细胞合成睾酮的关键酶和Nrf2/ARE抗氧化通路相关蛋白表达;qRT-PCR法检测相关炎症因子及睾酮合成关键酶基因的mRNA表达。结果显示,注射Rg1拮抗D-gal致小鼠衰老过程,衰老的睾丸间质细胞数量明显减少。Rg1体外拮抗D-gal致TM3细胞衰老作用后,细胞分泌睾酮水平无显著降低;IL-1、IL-6、IL-8等炎症因子的基因表达受到抑制;细胞内GSH-Px和CAT表达活性提高同时细胞产生丙二醛(MDA)与活性氧(ROS)能力受到抑制;StAR、3β-HSD及P450scc等睾酮合成关键酶基因及蛋白表达上调;Nrf2、HO-1等抗氧化蛋白表达上调,Keap1蛋白表达下调。研究提示,Rg1可能通过激活Nrf2/ARE抗氧化信号通路,拮抗D-gal对睾丸间质细胞的氧化应激损伤,进而调控睾丸雄激素的分泌功能。     

极化过程影响巨噬细胞的铁代谢

本文旨在研究巨噬细胞极化过程对自身铁代谢调节的影响。用20 ng/mLγ干扰素(interferon gamma, IFN-γ)刺激猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞) 24 h,诱导其为M1型巨噬细胞,另外用10 ng/mL白细胞介素4 (interleukin-4, IL-4)联合10 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)共同刺激3D4/2细胞24 h,诱导其为M2型巨噬细胞,用实时定量PCR、免疫荧光染色法和Western bolt检测巨噬细胞炎症因子和铁代谢相关蛋白的表达。收集M1/M2型巨噬细胞培养液上清液与猪肠上皮IPEC-J2细胞共培养,用CCK-8法检测IPEC-J2的增殖能力。给M1/M2型巨噬细胞外源添加柠檬酸铁铵(ammonium ferric citrate, FAC),用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran, FITC-dextran)及流式细胞术检测3D4/2细胞吞噬能力。结果显示,和对照组相比,M1型巨噬细胞铁调素、铁蛋白重链、轻链和脂质运载蛋白-2 mRNA表达水平上调,胞内铁含量增加,显示出铁保留的表型,并且铁可增强M1型巨噬细胞的吞噬能力;M2型巨噬细胞上述基因mRNA表达水平无显著变化,而铁转运蛋白和转铁蛋白受体mRNA表达水平上调,胞内铁含量减少,显示出铁释放的表型,并且其培养液上清液能促进IPEC-J2细胞增殖。上述结果提示,M1型巨噬细胞倾向于将铁保留在细胞内,减少胞外铁含量,从而抑制胞外菌的增殖;而M2型巨噬细胞倾向于释放铁,有助于周围细胞的增殖,从而促进组织修复。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠NRF2和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的改变

目的:通过观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺内红系衍生的核因子2相关因子2(NRF2)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表达,探索NRF2调控γ-GCS在COPD发病中可能的参与机制.方法:雄性Wistar大鼠16只,随机分COPD模型组和对照组.检测γ-GCS活性,γ-GCS的基因表达和NRF2的蛋白质表达.结果:γ-GCS 活性在COPD组中明显高于对照组.γ-GCS mRNA广泛高表达于COPD组支气管平滑肌细胞,而对照组相应部位呈弱表达.对照组肺匀浆中有一定量γ-GCS mRNA表达,但相对于COPD组仍较低.NRF2、γ-GCS在COPD组支气管上皮细胞胞浆中高表达,而对照组相应部位中呈弱表达.COPD组γ-GCS和NRF2蛋白表达皆有明显上调.NRF2蛋白表达与γ-GCS蛋白、mRNA表达呈正相关关系.结论:氧化应激可能通过使NRF2转录活性增加的方式上调NRF2,进而上调γ-GCS的表达,在COPD的发病中起重要作用.     

青藏高原黑果枸杞花青素对人肝癌细胞增殖和自噬的影响

探究黑果枸杞花青素在体外对人肝癌HepG2细胞增殖和自噬的影响。利用CCK-8法测定细胞活力,EdU和细胞划痕试验检测细胞增殖和迁移效果,RT-PCR和Western blot检测增殖和自噬相关基因的mRNA和蛋白表达。结果显示,黑果枸杞花青素可有效抑制人肝癌HepG2细胞的增殖和迁移;上调增殖因子(LATS1、LATS2和MOB1)和自噬因子(Beclin-1、LC3-Ⅱ和AMPK),并下调增殖因子YAP的mRNA水平;下调自噬因子p-mTOR和细胞周期因子CDK4,并上调自噬因子p-AMPK和LC3-Ⅱ的蛋白表达。由此推测黑果枸杞花青素可在体外抑制人肝癌HepG2细胞增殖和迁移,并促进人肝癌HepG2细胞发生自噬。     

2-甲氧基雌二醇对乳腺癌MCF-7细胞HIF-1α、CXCR4、VEGF表达的影响

目的:探讨2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol,2ME2)对乳腺癌MCF-7细胞生长及缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor1 α,HIF-1α)、趋化因子受体-4(CXC chemokine receptor-4,CXCR4)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响.方法:采用MTT法检测不同浓度2ME2对MCF-7细胞的增殖抑制作用;Hoechest 33258染色观察细胞凋亡形态学改变;RT-PCR、Western blot分别检测不同浓度2ME2对乳腺癌MCF-7细胞中HIF-1α、CXCR4、VEGF mRNA及蛋白表达水平的影响.结果:2ME2可较强的抑制MCF-7细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性;经2ME2作用48h后MCF-7细胞表现出典型的凋亡形态特征;不同浓度2ME2作用于MCF-7细胞48小时后,随着药物浓度的增加细胞中HIF-1α、CXCR4、VEGF在mRNA及蛋白表达水平逐渐降低,与对照组相比有统计学意义(P＜0.05).结论:2ME2可通过降低HIF-1α、CXCR4、VEGFmRNA及蛋白表达,抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖及肿瘤血管生成和侵袭转移相关因子的表达.     

靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响

目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA,分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2,依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平,免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达;MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达;成功转染后,细胞处于内质网应激（ER stress）状态时,各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较,差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2,有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达;细胞处于ERS状态时,IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖;抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。     

芦丁通过激活NRF2/HO-1通路抑制Ang II诱导的血管平滑肌细胞表型转化和炎症反应

摘要 目的：探讨芦丁（Rutin）对血管紧张素II（Angiotensin II，Ang II）诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转化和炎症反应的影响及机制。方法：采用Ang II处理小鼠主动脉平滑肌细胞构建表型转化和炎症反应模型。将对数生长期的小鼠主动脉血管平滑肌细胞分为以下4组：正常对照组（Control组），Rutin组（100 μM），Ang II组（1μM），Rutin+ Ang II组（100 μM，1 μM）。采用细胞增殖实验（Cell Counting Kit-8，CCK8）检测芦丁对小鼠主动脉平滑肌细胞活力的影响，采用蛋白免疫印迹实验检测α平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌蛋白22α（Smooth muscle protein 22-alpha，SM22α）、骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）、基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase 2，MMP2）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，MMP9）、白细胞介素6（Interleukin 6，IL6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）、核因子活化B细胞κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）的蛋白表达和磷酸化水平，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞上清中TNF-α和IL6细胞因子水平，采用荧光显微镜和流式细胞术检测小鼠主动脉血管平滑肌细胞活性氧水平。结果：与对照组相比，Ang II组收缩型标志物α-SMA和SM22α表达水平降低、合成型标志物OPN表达水平升高，炎症相关因子MMP2、MMP9、IL6和TNF-α表达水平升高，NRF2和HO-1表达水平降低，NRF2及NF-κB的磷酸化增加。此外，相较于Ang II组，Rutin+ Ang II组收缩型标志物α-SMA和SM22α表达水平升高、合成型标志物OPN表达水平降低，炎症相关因子MMP2、MMP9、IL6和TNF-α表达水平降低，NRF2和HO-1表达水平升高，NRF2及NF-κB的磷酸化水平降低。结论：芦丁可以抑制Ang II诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转化和炎症反应，可能与其激活NRF2/HO-1通路和抑制活性氧的产生有关。     

沉默DAXX基因表达促进人卵巢癌细胞凋亡和衰老

DAXX是Fas死亡结构域相关蛋白(Fas death-associated protein,DAXX),可与Fas死亡受体的死亡域结合.通过激活c-Jun NH2末端激酶通路,DAXX增强Fas介导的凋亡,同时也增强转录生长因子β依赖的凋亡.本研究通过免疫组化检测人正常卵巢组织和卵巢癌组织中DAXX蛋白表达,然后通过Tet-on诱导体系构建DAXX基因沉默的慢病毒,感染卵巢癌细胞后,加入嘌呤霉素筛选稳定表达的OV2008细胞,四环素诱导DAXX基因沉默,通过免疫印迹和定量PCR检测DAXX基因干扰效果,MTT检测细胞增殖,克隆形成实验检测克隆形成能力,免疫印迹和免疫荧光方法检测DNA损伤蛋白的变化,SA-β-gal检测细胞衰老.结果表明,在人正常卵巢组织中DAXX低表达,而在人卵巢癌组织中DAXX高表达,随着四环素浓度的增加DAXX的表达量降低,DAXX基因沉默抑制卵巢癌OV2008细胞的增殖和克隆形成.免疫印迹结果显示,DAXX基因沉默可诱导DNA损伤相关蛋白p-H2AX和p-CHK2高表达.SA-β-gal检测结果表明,DAXX基因沉默可诱导OV2008细胞发生衰老,免疫印迹检测发现,p21和p27在DAXX沉默的卵巢癌细胞中高表达.综上结果,DAXX沉默可以抑制卵巢癌细胞的增殖和克隆形成,同时也促进卵巢癌细胞发生DNA损伤和衰老.该研究为卵巢癌的基因治疗提供新的思路.