SHIV1157ipd3N4中国恒河猴细胞适应株静脉感染中国恒河猴有效浓度的确定

目的确定SHIV1157ipd3N4静脉途径感染中国恒河猴的有效病毒浓度,明确SHIV1157ipd3N4感染实验猴体内病毒复制和免疫损伤情况。方法 10只正常中国恒河猴分成6组,分别用10倍系列稀释的病毒液1 mL静脉感染,测定血浆病毒载量,CD4＋/CD8＋,CD4＋T淋巴细胞绝对数,分析感染后恒河猴体内病毒复制和免疫损伤情况。结果 5TCID50/mL以上浓度的SHIV1157ipd3N4能通过静脉途径感染中国恒河猴。结论该实验的成功进行为SHIV/中国恒河猴疾病及评价模型的建立奠定了良好的基础,为今后使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的为了完善现有的SIV／恒河猴模型,掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态,为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考,我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平。方法实验前选出4只无SIV、sTLV、SRV／D和B病毒感染的恒河猴,用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴,使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法,监测SIVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况,持续测定一年。结果实验结果显示IFN-γ ELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况,IFN—YELISPOT结果和CD4＋T细胞数无相关性,与血浆病毒载量稍有相关。结论本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围,了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系,完善了SIV／SAIDS模型评价指标,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件。     

RT-SHIV感染中国恒河猴及体内传代

目的了解RT-SHIV感染中国恒河猴的感染特点,研究RT-SHIV在中国恒河猴中传代特点;建立RT-SHIV中国恒河猴动物模型,为评价HIV-1药物有效性提供动物平台。方法选择4只健康恒河猴,其中两只动物经上肢静脉感染RT-SHIV病毒,感染急性期采取外周血分离CD8-PBMC,扩增病毒,将新制备的病毒静脉感染另外两只中国恒河猴,通过监测血浆病毒载量,CD4＋/CD8＋比值,CD4＋T淋巴细胞和B淋巴细胞的绝对数,了解实验猴的感染状态,同时分析病毒RT基因变异情况。结果 4只动物均获得系统性感染,且传代动物急性期表现更为强烈,RT基因在感染和传代的过程中共观察到3个氨基酸的改变。结论本研究为RT-SHIV中国恒河猴模型的建立提供了基础信息。     

CXCR4嗜性SHIVKU-1病毒静脉感染中国恒河猴初步研究

目的了解SHIVKU一1静脉途径感染中国恒河猴的感染特点及进展规律。方法两只健康中国恒河猴,静脉感染SHIVKU-1病毒,定期采样检测血浆病毒载量、CD4＋／CD8＋比值、CD4＋T细胞绝对数变化和血清中抗SHIVKU-1特异性IgG抗体水平。多色流式技术分析外周血、腹股沟淋巴结和十二指肠粘膜固有层CD4＋T淋巴细胞记忆细胞亚群变化。结果两只实验猴成功感染SHIVKU-1病毒,一直到感染后3个月均保持稳定水平的病毒载量。外周血CD4＋T淋巴细胞下降明显,CD4＋／CD8＋T细胞比值严重倒置。CD4＋Tcm细胞比例在经历了感染早期的下降后,大幅升高,尤其是外周血和淋巴结。CD4＋Tem则在粘膜固有层中增加明显。结论SHIVKU．1静脉途径成功感染了中国恒河猴,为SHIV／中国恒河猴疾病及评价模型的建立奠定了良好的基础,为今后使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

体内CD8^＋T细胞剔除对无症状期SHIV感染猴的影响

目的 CD8＋T细胞在一些病毒感染疾病的免疫反应中起着重要的作用,但CD8＋T细胞在HIV无症状期的作用尚不明确,本研究通过体内CD8＋T细胞剔除,研究CD8＋T细胞对SHIV感染猴的影响,进一步了解艾滋病的发病机制。方法选择8只SHIV病毒感染的恒河猴,均处于无症状期,随机分成两组,实验组4只恒河猴在0、3、7 d注射抗CD8＋T抗体cM-T807,不同的时间取外周血、腹股沟淋巴结。流式细胞术测定恒河猴外周血和淋巴结中CD8＋T细胞数目,Real-time RT-PCR法测定实验猴血浆病毒载量,并使用IFN-γElispot方法测定其对猴细胞免疫的影响。结果 CD8＋T细胞敲除后,4只猴的病毒载量都转阳,但反应性不一,HIV-1的靶细胞CD4＋T细胞有轻微下降,后反弹,与病毒载量无相关性;CD8敲除猴的感染情况（血浆病毒载量和CD4细胞）比SHIV病毒急性感染轻,这与ELIPOT结果一致。结论 CD8＋T细胞在HIV无症状期发挥重要的作用,但其作用具有个体差别。     

SIVmac239感染恒河猴急性期回肠派氏淋巴结中淋巴细胞亚群的变化

目的分析SIVmac239感染早期中国恒河猴回肠派氏淋巴结淋巴细胞数量及亚群的变化,探讨这些变化与疾病进展的可能关系。方法以静脉注射SIVmac239制备恒河猴AIDS模型,对回肠派氏淋巴结进行CD4和CD8免疫组化标记,分离Peyer’s集合淋巴结淋巴细胞,分别标记CD3、CD4、CD8、CD28、CD95单克隆抗体,以流式细胞仪检测T细胞及其亚群的表达情况。结果 SIVmac239感染急性期中国恒河猴Peyer淋巴结中CD4＋/CD8＋比值持续下降,记忆性细胞比例升高,但Peyer淋巴结形态及CD4＋T细胞数量未见明显变化,CD8＋T细胞从第5天开始持续升高。结论 SIVmac239感染急性期,中国恒河猴回肠派氏淋巴结形态及CD4＋T细胞数量基本维持,向记忆性细胞的转化增加,但是CD4＋/CD8＋比值下降。     

B亚型SHIV_（SF162p3）中国恒河猴小剂量多次阴道黏膜感染

目的模拟HIV性传播感染特点进行中国恒河猴阴道黏膜小剂量多次感染研究,为我国艾滋病疫苗有效性评价提供新的模型构建思路。方法选用20-30TCID50剂量的SHIVSF162p3病毒阴道黏膜途径感染六只成年雌性中国恒河猴,共感染13次,每次攻毒间隔4～7 d。采取测定血浆病毒载量和外周血CD4＋∶CD8＋。结果 6只中国恒河猴经13次病毒攻击后,经检测均建立系统性感染,血浆病毒载量呈阳性;CD4＋∶CD8＋均有下降。结论成功建立了中国恒河猴阴道黏膜小剂量多次感染模型,为艾滋病研究提供了新的更接近于自然感染状态的模型建立模式。     

打靶恒河猴CD4~+ T细胞的TRIM5α基因影响其感染HIV的能力

目的:探讨打靶恒河猴CD4~+ T细胞的TRIM5α基因对其感染HIV-1能力的影响。方法:从恒河猴的外周血中通过磁珠分选获得CD4~+ T细胞,并采用流式检测阳性率。构建打靶TRIM5α基因的TALEN质粒,通过电转导入CD4~+ T细胞,流式分选出转染TALEN质粒的细胞,提取基因组T7E1酶切检测打靶效率。HIV-1病毒感染打靶TRIM5α的CD4~+ T细胞,并通过ELASA检测病毒感染的情况。结果:成功地从恒河猴的外周血中分选出了CD4~+ T细胞,流式检测阳性率为99.5%。打靶TRIM5α基因的TALEN质粒转染CD4~+ T细胞的转染效率约为24.8%,并可成功打靶TRIM5α,打靶效率约为40%。ELASA检测结果表明打靶TRIM5α的恒河猴CD4~+ T细胞对HIV病毒的感染能力增强。结论打靶恒河猴CD4~+ T细胞的TRIM5α基因可使其易感HIV病毒,为进一步建立恒河猴HIV-1感染动物模型奠定基础。     

SIVmac239病毒经不同途径感染恒河猴急性期CD4~＋T细胞数量与其细胞表面CD95表达量的变化关系

目的研究SIVmac239病毒分别通过直肠（rectal infection：IR）及静脉（intravenous infection：IV）感染恒河猴,在感染急性期外周血CD4＋T细胞数量与其细胞表面的死亡受体（CD95）表达量之间的变化关系。方法将SIVmac239经直肠及静脉途径各感染14只恒河猴。监测病毒载量、CD4＋T淋巴细胞数量及CD4＋/CD8＋比值的变化,从而明确感染。同时,在感染急性期内9个时间点采集静脉血,并利用流式细胞术分析CD4＋T细胞表面CD95的表达量。结果静脉组恒河猴CD95表达量于第2天开始升高,第7天达到最高,同时CD4＋T淋巴细胞数降到最低。直肠组恒河猴也于感染后第2天开始升高,但第10天才达到最高值,CD4＋T淋巴细胞数于第17天降到最低。同静脉组相比,直肠组CD95表达量增高及CD4＋T细胞数降低均较晚出现,且其CD4＋T细胞数量降至最低晚于CD95表达量达到峰值一周后出现。结论 SIVmac239经直肠及静脉感染恒河猴后,伴随CD4＋T细胞表面CD95表达的升高,CD4＋T细胞数量逐渐下降。但不同感染途径对CD4＋T细胞表面CD95的表达量与CD4＋T淋巴细胞数的变化不尽相同,这可能由于不同感染途径造成CD95在感染急性期CD4＋T细胞数量降低中发挥的作用不同。     

H5N1接种恒河猴和食蟹猴后外周血细胞变化的分析

目的测定H5N1型禽流感病毒感染恒河猴、食蟹猴后,其外周血细胞的变化,为H5N1模型猴提供基础数据及研究参考。方法健康合格食蟹猴、恒河猴各4只,经滴鼻方式接种H5N1病毒107TCID50,确认发病后,在不同时间点进行血细胞及T淋巴细亚群的分析。结果与接种H5N1病毒前比较,接种后白细胞总数（WBC）在第6天时有所降低,至第9天时回升;红细胞总数（RBC）在第3天有所降低,之后回升;淋巴细胞比例及数量分别在第6天、第9天升高并达到最高值。至第9天时,CD4^＋T细胞数明显高于接种前,CD8^＋T细胞数上升显著,导致CD4^＋/CD8^＋T细胞比例下降,甚至在2只食蟹猴出现了比例倒置。结论实验用猴感染H5N1后,可导致WBC,CD4^＋,CD8^＋T等血液细胞的变化,应作为H5N1模型动物的检测指标。     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性。方法用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常中国恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性。结果本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL。1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上。结论此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型。     

C亚型SHIVCHN19P4强毒株在中国恒河猴体内的传代研究

目的研究C亚型SHIVCHN19P4强毒株在中国恒河猴体内传代中病毒学和免疫学等反应的变化特点,分离制备SHIVCHN19P4中国恒河猴传代适应株病毒。方法选择4只健康成年恒河猴,其中两只经后肢静脉感染SHIVCHN19P4病毒,60 d后,分别采集EDTA抗凝全血静脉途径传代至另两只猴,使用流式细胞术、PCR、结合抗体检测和序列分析等方法研究传代动物病毒学、免疫学和序列变异特点。选择性从传代动物感染急性期外周血中分离PBMC,CD8＋T细胞敲除后与正常PBMC共培养分离病毒。结果 4只传代动物均获得系统性感染,且传代后病毒毒力明显增强,序列分析发现SHIVCHN19P4病毒序列在传代过程中发生适应性改变;同时,成功分离制备SHIVCHN19P4传代适应性病毒株。结论 SHIVCHN19P4在中国恒河猴体内适应性传代研究为进一步建立C亚型SHIV强毒株/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为研究C亚型HIV-1流行株致病特点以及预防性黏膜疫苗和杀微生物的有效性评价提供了数据支持。     

Induction of AIDS by simian immunodeficiency virus from an African green monkey: species-specific variation in pathogenicity correlates with the extent of in vivo replication.

Previous studies suggested that simian immunodeficiency viruses isolated from African green monkeys (SIVagm) are relatively nonpathogenic. The report describes the isolation and biologic and molecular characterization of a pathogenic SIVagm strain derived from a naturally infected African green monkey. This virus induced an AIDS-like syndrome characterized by early viremia, frequent thrombocytopenia, severe lymphoid depletion, opportunistic infections, meningoencephalitis, and death of five of eight macaques within 1 year after infection. An infectious clone derived from this isolate reproduced the immunodeficiency disease in pig-tailed (PT) macaques, providing definitive proof of the etiology of this syndrome. Although the virus was highly pathogenic in PT macaques, no disease was observed in experimentally infected rhesus macaques and African green monkeys despite reproducible infection of the last two species. Whereas infection of PT macaques was associated with a high viral load in plasma, peripheral blood mononuclear cells, and tissues, low-level viremia and infrequent expression in lymph nodes of rhesus macaques and African green monkeys suggest that differences in pathogenicity are associated with the extent of in vivo replication. The availability of a pathogenic molecular clone will provide a useful model for the study of viral and host factors that influence pathogenicity.     

Pathogenicity of simian-human immunodeficiency virus SHIV-89.6P and SIVmac is attenuated in cynomolgus macaques and associated with early T-lymphocyte responses

Because most studies of AIDS pathogenesis in nonhuman primates have been performed in Indian-origin rhesus macaques (Macaca mulatta), little is known about lentiviral pathogenicity and control of virus replication following infection of alternative macaque species. Here, we report the consequences of simian-human immunodeficiency virus SHIV-89.6P and SIVmac251 infection in cynomolgus (Macaca fascicularis) and rhesus macaques of Chinese origin. Compared to the pathogenicity of the same viruses in Indian rhesus macaques, both cynomolgus and Chinese rhesus macaques showed lower levels of plasma virus. By 9 to 10 months after infection, both viruses became undetectable in plasma more frequently in cynomolgus than in either Chinese or Indian rhesus macaques. Furthermore, after SHIV-89.6P infection, CD4+ T-cell numbers declined less and survival was longer in cynomolgus and Chinese rhesus macaques than in Indian rhesus macaques. This attenuated pathogenicity was associated with gamma interferon ELISPOT responses to Gag and Env that were generated earlier and of higher frequency in cynomolgus than in Indian rhesus macaques. Cynomolgus macaques also developed higher titer neutralizing antibodies against SHIV-89.6 at 10 and 20 weeks postinoculation than Indian rhesus macaques. These studies demonstrate that the pathogenicity of nonhuman primate lentiviruses varies markedly based on the species or geographic origin of the macaques infected and suggest that the cellular immune responses may contribute to the control of pathogenicity in cynomolgus macaques. While cynomolgus and Chinese rhesus macaques provide alternative animal models of lentiviral infection, the lower levels of viremia in cynomolgus macaques limit the usefulness of infection of this species for vaccine trials that utilize viral load as an experimental endpoint.     

Molecular clones of SIVsm and SIVagm: experimental infection of macaques and African green monkeys

We have investigated the ability of biologically-active proviral molecular clones of SIVsm and SIVagm to infect rhesus macaques, pig-tail macaques, and African green monkeys. Two clones of SIVsm were individually inoculated into four rhesus and four pig-tail macaques. All eight macaques became infected, and two have experienced a significant decline in absolute numbers of circulating CD4+ cells. None of three African green monkeys were infected by an SIVsm molecular clone. However, one of four African green monkeys did become infected by SIVsm after receiving lymphocytes directly from an SIVsm-infected rhesus macaque. A molecular clone of SIVagm infected three of four macaques and three of three African green monkeys. None of the three infected macaques had a significant decline in circulating CD4+ cells. Interestingly, infection of pig-tail macaques (but not rhesus macaques) with uncloned SIVagm induced a significant drop in circulating CD4+ cells. These data suggest that molecular clones of SIVsm and SIVagm can be used in experimental models of AIDS for the evaluation of viral gene functions and for the study of in vivo genetic variation.