茯苓原生质体制备与再生条件的研究

研究了酶、酶解时间、菌龄、稳渗剂等对茯苓原生质体制备与再生的影响。茯苓原生质体制备的最佳条件为:纤维素酶(1．5%)和蜗牛酶(1．5%)的等量混合酶解系统,酶解时间3h,7d菌龄菌丝,产量可达1．77×10~7个/mL。以甘露醇为稳渗剂,采用CYM再生培养基,酶解时间3h,7d菌龄菌丝,其原生质体再生率最高,为0．164%。这一结果为茯苓通过原生质体技术进行菌种改良提供了重要技术参数。     

姬松茸原生质体形成和再生的研究

报道了溶壁酶系统、酶浓度、不同菌龄、脱壁促进剂、渗透压稳定剂和酶解温度对姬松茸原生质体释放率及不同再生培养基、渗稳剂种类、菌丝酶解时间和单双层平板对原生质体再生的影响。结果表明 ,菌龄为3～ 5d的菌丝以 1.5 %溶壁酶、0 .5 %蜗牛酶和 0 .5 %纤维素酶组成的酶系统在 30℃以KCl为渗透压稳定剂时 ,形成率为 1.4～ 1.5ⅹ 10 7/mL酶液 ;以蔗糖为渗透压稳定剂 ,菌丝酶解 1.5～ 3h ,以SMY和MYP为再生培养基 ,姬松茸原生质体再生率为 1.1‰～ 1.3‰。     

白腐真菌原生质体制备和再生条件的研究

对影响白腐真菌(5．776)原生质体制备和再生的条件：包括菌龄、水解酶液的种类及浓度、酶解温度、酶解时间、再生培养基的稳渗剂的选择进行了研究。通过单因素比较分析和正交实验得到最适合的白腐真菌原生质体制备和再生条件。结果表明：当菌龄为58h,采用1%纤维素酶和1%蜗牛酶(2：1)混合液,酶解温度30℃,酶解时间180min,用0．7mol/L氯化钠作渗透压稳压剂,白腐真菌(5．776)原生质体的形成数和再生率均比优化前大为提高,原生质体形成量为8．36×10~5个/mL,原生质体再生率为9．12%。     

桃褐腐病菌(Monilia fructigena)原生质体制备及再生条件

以桃褐腐病菌(Monilia fructigena)为供试菌株,研究了酶系组成、液体培养基、菌龄、酶解温度、酶解时间对原生质体制备的影响,以及等渗液、固体再生培养基、酶解时间对原生质体再生的影响。结果表明:Fries(1/2)液体培养基培养24h,在10mg/mL崩溃酶+5mg/mL纤维素酶+20mg/mL蜗牛酶+10mg/mL溶菌酶的混合酶液中28°C酶解4h为桃褐腐病菌原生质体制备的最佳条件。采用液体再生涂布平板法,以含Ca2+的STC为等渗液的液体培养基和含蔗糖及Ca2+的Fries(1/2)固体培养基为桃褐腐病菌原生质体再生的最佳条件。经过观察与测定,再生菌株保持了原有的培养性状和致病性,接种桃果实后发病率为100%。     

松茸菌丝原生质体形成与再生条件的研究

采用多因素实验正交优选法比较不同酶、渗透压稳定剂、菌丝生理状况、菌丝培养基、预处理液和酶解时间等因素对松茸原生质体形成的影响和再生培养基、明胶、酪蛋白对松茸原生质体再生的影响.以0.6MMgSO4作为渗透压稳定剂,2-硫基苏糖醇为预处理液,用2%蜗牛酶在30℃酶解6h,每克菌丝可以得到1×106个原生质体.再生最优条件0.6MMgSO4,PDY再生培养基,2.5%明胶,松茸菌丝再生率最高4.97%.     

氦氖激光、紫外复合诱变天麻素产生菌华根霉LN-A的原生质体

本文通过研究酶组合、酶浓度、酶作用时间和菌龄等因素对天麻素产生菌华根霉(Rhizopus chinensis) LN-A原生质体制备和再生的影响, 总结出了原生质体制备和再生的最佳条件: 选用对数生长期的菌株, 以蜗牛酶5 mg/mL + 纤维素酶5 mg/mL + 溶菌酶2 mg/mL 30°C保温处理2 h, 原生质体形成率达5.8×107, 原生质体再生率为5.7%。在此基础上首次利用He-Ne激光、紫外线复合诱变天麻素合成菌的原生质体, 当选用15 mW的He-Ne激光辐射原生质体20 min, 再用紫外辐照150 s时获得了转化率及天麻素得率都明显提高的突变株, 其天麻素得率比出发菌株提高20%以上。     

毛栓菌原生质体制备和再生及单核菌株产漆酶特性

毛栓菌Trametes hirsuta能有效地降解木质素,在生物燃料、制浆和饲料工业等方面具有很高应用价值。为了获得遗传性能稳定的T. hirsuta单核菌株,研究了其菌丝生长培养基的类型、菌丝生长时间（菌龄）、酶解时间、原生质体纯化离心速度和原生质体再生培养基类型对T. hirsuta YJ-9-1原生质体制备与再生的影响;采用DAPI染色和锁状联合缺失的观察,从再生株中筛选单核菌株并考察其产酶特性。结果表明：采用YGM菌丝生长培养基、88h菌龄、1h酶解时间、4,000r/min原生质体纯化离心速度以及YGMS再生培养基,最终可获得密度大约为5.0×106个/mL的原生质体悬浮液和9.1%的再生率;从200株再生菌株中筛选出了3株单核菌株,其中一株单核菌株D-2-1的漆酶产量比原菌T. hirsuta YJ-9-1明显提高,在第12天其漆酶酶活为771.67U/L,是原菌的1.51倍。     

碱性普鲁兰酶产生菌的原生质体制备与诱变选育

研究报道了Bacillus sp SX—12原生质体制备与再生最佳条件。实验表明,在液体完全培养基中加入2％的甘氨酸培养10h,原生质体制备最佳条件为：溶菌酶浓度0．5mg／mL,酶解温度37℃,酶解时间1．5h时原生质体形成率为93．8％。原生质体形成最佳高渗稳定剂为甘露醇,再生率26．4％。在原生质体制备的最佳条件下,用紫外线诱变技术选育产碱性普鲁兰酶的高产菌株。筛选到1株高产菌株SX—12C87,酶活由出发菌株的2．42μ／mL提高到6．87μ／mL,提高了约1．8倍。     

大丽轮枝菌原生质体的制备及再生

为建立大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)原生质体的制备和再生体系,采用单因素分析法分析了大丽轮枝菌摇培时间、裂解酶浓度、酶解时间和温度、渗透压稳定剂的种类和浓度及pH对原生质体释放的影响;从再生培养基、培养基Agar浓度和酶解时间对原生质体的再生条件进行了优化;并对优化条件下获得的原生质体进行了GFP瞬时表达。结果表明,将分生孢子培养18 h收集菌丝体,以1.2 mol/L的KCl作为渗透压稳定剂,在pH 6.0的条件下,加入10 mg/m L的裂解酶,30℃酶解4 h时,获得的原生质体产量最高,达到3.3×10~7个/mL;在Agar浓度为0.5%的TB3再生培养基中进行原生质体再生,再生率最高,可达22.45%;GFP瞬时表达结果表明,优化条件下获得的原生质体可用于遗传转化材料。     

木质层孔菌原生质体的制备与再生条件的研究

目的：提高木质层孔菌原生质体的产量和再生率,为进一步诱变育种提高菌株产木质纤维素酶活力打下基础。方法：通过单因素实验分别筛选合适的酶浓度、菌丝的菌龄、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂与pH值。结果：在酶解液浓度为2.0%纤维素酶＋2.0%蜗牛酶、菌龄60h、酶解温度32℃、酶解时间3h,以0.8mol/L的NaCl溶液为渗透压稳定剂,pH值为5.0时,原生质体形成量达4.13×10^5个/mL,再生率可达6.95%。有效地提高了木质层孔菌原生质体的产量和再生率。     

人参皂苷F1转化菌株的原生质体诱变育种

菌核青霉2246(Penicillium sclerotiorum)能够将人参皂苷Rg1转化为人参皂苷F1.以此菌为出发菌株,进行原生质体制备和再生的研究,确定原生质体的最佳形成条件:菌丝体培养24 h,用5 mg/mL溶壁酶、5mg/mL纤维素酶和5 mg/mL蜗牛酶的混合酶液进行酶解,以0.8 mol/L的KCI作为渗透压稳定剂,31℃水浴振摇2h.并对形成的原生质体进行亚硝基胍复合紫外线照射诱变,结果得到1株转化率显著提高、遗传性能稳定的诱变株( NU-1),其转化率由16.7％提高到30.5％.     

利用荧光染色和流式细胞技术辅助卵孢小奥德蘑原生质体制备与再生研究

本研究以卵孢小奥德蘑液体培养菌丝作为实验材料,利用单因子变量法探索研究了菌丝培养时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型对卵孢小奥德蘑原生质体制备的影响,并对原生质体再生培养基进行选择和优化。通过荧光染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对原生质体的制备过程、得率和活力进行研究。结果表明,将卵孢小奥德蘑菌丝在液体培养基中培养5d收集菌丝体,以甘露醇作为渗透压稳定剂,在溶壁酶浓度2%、30℃条件下酶解5h,获得的原生质体得率最高,达2.0×10 ⁷个/mL;通过流式细胞仪分析,约57.69%的原生质体细胞为活细胞;在RM培养基中再生效果最好,再生率为(0.103±0.025)%。研究结果可以为卵孢小奥德蘑育种与食用菌原生质体制备再生提供研究基础。     

金龟子绿僵菌原生质体的制备和再生及其羟化酶活性研究

对金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)原生质体的制备和再生的影响因素进行实验,并在此基础上考察了甾体底物对原生质体羟化酶的诱导作用。结果表明,原生质体制备的合适条件是:42 h的菌丝体用纤维素酶(10 mg/mL)和蜗牛酶(5 mg/mL)的混合酶在含有0.8 mol/L甘露醇的pH 5.8磷酸缓冲液中,28℃震荡(80 r/min)酶解3 h,原生质体产量可达到6.12×10~7/mL,在含有0.6 mol/L KCl的双层马铃薯培养基上再生率达到7.79%。经过6 h底物诱导的菌丝体制备的原生质体细胞色素P450的表达量比没经过诱导的菌丝体制备的原生质体高约40%,证明该菌羟化酶系统的可诱导性。由于没有细胞壁的阻碍经过底物诱导的原生质体能够高效的将底物转化为产物,且副产物相对较少。     

γ-亚麻酸生产菌深黄被孢霉原生质作的形成和再生

采用2％的溶壁酶加4％的蜗牛酶,从深黄被孢霉的菌丝中获得了大量的原生质体。同时对菌丝的培养时间、渗透压稳定剂、酶解系统和酶解温度等因素进行了系统的观察,从而获得了制备深黄被孢霉原生质体的最适条件。并对该原生质体在高渗培养基上进行了再生实验,其再生率为32％。     

卷枝毛霉孢子原生质体的制备与再生

为了构建高产γ-亚麻酸的卷枝毛霉稳定遗传转化体系,利用酶解法对卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)EIM-10的孢子进行原生质体制备。研究酶液组成、渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间等对卷枝毛霉孢子原生质体形成和再生的影响,建立了制备卷枝毛霉孢子原生质体的最适条件:1%纤维素酶和2%溶壁酶为酶解体系,0.5mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,酶解温度32℃,酶解时间2.5 h,再生培养基为0.5 mol/L NaCl高渗培养基。用双层平板培养法进行原生质体再生,在此条件下原生质体的形成量为1.2×106个/mL,再生率为70.5%。     

Protoplast formation and regeneration in <Emphasis Type="Italic">Lactobacillus delbrueckii</Emphasis>

Method for production and regeneration of Lactobacillus delbrueckii protoplasts are described. The protoplasts were obtained by treatment with a mixture of lysozyme and mutanolysin in protoplast buffer at pH 6.5 with different osmotic stabilizers. The protoplasts were regenerated on deMan, Rogosa and Sharpe (MRS) with various osmotic stabilizers. Maximum protoplast formation was obtained in protoplast buffer with sucrose as an osmotic stabilizer using a combination of lysozyme (1 mg/ml) and mutanolysin (10 μg/ml). Maximum protoplast regeneration was obtained on MRS medium with sucrose (0.5 M) as an osmotic stabilizer. The regeneration medium was also applicable to other species of lactobacilli as well. This is, to our knowledge, the first report on protoplast formation and efficient regeneration in case of L. delbrueckii.     

米曲霉两株营养缺陷型原生质体的形成和再生的条件实验*

采用1%溶壁酶加1%玛瑙螺酶(褐云玛瑙螺消化液的冷冻干粉)的混合酶,自米曲霉(Aspergillus oryzae)的两株营养缺陷型中获得了大量的原生质体,并比较了渗透压稳定剂、温度、菌丝体的培养基成分等因素对原生质体形成和再生的作用。无机盐类稳定剂(NaCl、KCl)获得了高产量的原生质体,而有机类(蔗糖、甘露醇、山梨醇)做为稳定剂不甚理想。对120和720菌株的原生质体在高渗再生培养基上进行再生试验,再生率分别为52%和65%。     

黄曲霉菌原生质体的制备和再生技术优化

黄曲霉菌的遗传转化是研究黄曲霉菌致病相关功能基因的前提和基础,而原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。本文分别以黄曲霉孢子和菌丝为材料,研究不同条件下黄曲霉原生质体的形成和再生,结果表明,黄曲霉孢子在酶液浓度为纤维素酶∶蜗牛酶∶溶壁酶=1.5%∶1.5%∶1.5%,30℃酶解3 h,原生质体制备率高达97.3%,再生率达89.2%;黄曲霉菌丝在菌龄为42 h,酶液浓度为纤维素酶∶蜗牛酶∶溶壁酶=1.5%∶1.5%∶1.5%,30℃酶解1 h,可获得最高原生质体产量为2.0×10^6个/m L,再生培养基中以1 mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂时,原生质体再生率达5.5%。故本实验条件下,黄曲霉孢子原生质体的形成和再生优于菌丝。     

斜卧青霉原生质体制备和再生的研究

研究了斜卧青霉原生质体制备和再生的条件,确定了培养方式、菌龄、渗透压稳定剂、酶的配比、酶解时间等因素对原生质体制备和再生的影响。最佳条件：菌丝体培养12h,用1％溶壁酶＋1％纤维素酶＋1％蜗牛酶的混合酶液酶解,将NaCl作为渗透压稳定剂,酶解时间为1．5h。在此条件下原生质体的形成量达到5．3×10^5个／mL,再生率为19．4％。     

银耳原生质体分离与再生条件优化研究*

应用正交设计,研究不同菌株(Tr01、Tr21)、材料(芽孢、菌丝体、子实体)、溶壁酶浓度和酶解温度对原生质体产量的影响。实验结果表明,实验材料对原生质体产量影响最大,以芽孢为材料原生质体产量可达到2.75×107个/ml,而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2.5×106个/ml 和1.0×106个/ml;在35℃下酶解,原生质体产量高;溶壁酶浓度在1%~3%范围内对原生质体产量影响不大;不同菌株原生质体产量差异不显著。本实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影响,结果表明,0.5 mol/L~0.7 mol/L的KCl 对原生质体再生没有显著差异,再生率最高可达32.3%。