抗虫转基因欧洲黑杨的培育

用带有３５Ｓ－Ω－Ｂｔ－ＮＯＳ嵌合基历的双元载体的农杆菌ＬＢＡ４４０４转化欧洲黑杨的叶片外植体,共独行５４株转化再生植株,用这些再生植物对杨尺蠖进行毒力测定,昆虫校正死亡率在８０－９６％的再生植株占总测定植株的１５％。部分再生植株对舞毒娥进行测定,表明在５－９天内校正死亡率高达１００％,存活昆虫的生长和发育也明显地受到抑制。根据苗木在苗圃中高生长的昆虫校正死亡率采用重心聚类法进行分析。初步选出高生     

转双抗虫基因烟草的研究

用改造的雪花莲凝集素基因GNAmm与合成的苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白cry1Ac基因构建了带有双价基因的植物表达载体,在该表达载体中这两个基因的转录分别受笋瓜PP2启动子(SPP2P)和CaMV 35S启动子的调控。通过根癌土壤杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。PCR检测及基因组DNA Southern blot\,Slot blot杂交分析的结果表明Gna基因和Bt基因已整合到烟草总DNA中。用Bt毒蛋白抗血清进行Western blot分析,转基因植株均有Bt杀虫蛋白的不同程度的表达。对转化再生烟草的虫试结果表明,在所受试的19株烟草中60%的植株上的棉铃虫在5天内死亡率达到100%,而且存活幼虫的生长发育受到明显抑制;蚜虫抑制生长试验表明,多数转化再生植株具有较强的抗蚜活性,平均能够抑制桃蚜50%～60%的蚜口密度,有的高达80%以上。以上结果表明利用这两个改造过的抗虫基因可以获得既抗虫又耐蚜的转双抗虫转基因植物。     

抗虫的转AaIT基因杨树的获得

通过根癌农杆菌叶盘法将构建在双元载体上的昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因转化至中国南方杨树N106(小叶杨×美洲黑杨,P.deltoides×P.simonii)中,共获得了62株再生植株。PCR分析及PCR产物Southernblotting的分析结果表明,AaIT基因整合在再生植株的基因组上。对部分转AaIT基因植株进行了杀虫实验,转基因植株A5对一龄舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫有明显的抗性,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因对照植株,其取食面积小,存活幼虫体重明显小于对照。ELISA分析证明了AaIT蛋白的表达。     

导入蜘蛛杀虫肽基因的烟草具有抗虫性

用带有杀虫肽基因的农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４ 转化烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ）叶片,共获得３０ 株抗卡那霉素的再生植株． 用这些再生植株对棉铃虫（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍ ｉｇｅｒａ）进行毒力测定,有３ 株转杀虫肽基因植株对棉铃虫有较强抗性． 与对照相比,这３ 株转基因烟草的杀虫率可达３０％～４５％ ,并能显著抑制昆虫蜕皮和生长发育,表现出明显的抗虫作用． 以这３ 株为主进行了ＰＣＲ 扩增及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ实验,结果表明杀虫肽基因已插入到这３ 株植株的基因组中并表达出有活性的杀虫肽     

转果聚糖蔗糖转移酶基因(Sac B)美丽胡枝子的获得

采用农杆菌介导的遗传转化方法,将来自枯草杆菌的果聚糖蔗糖转移酶基因(Sac B) 导入美丽胡枝子,以提高胡枝子抵御干旱胁迫和盐胁迫的能力。以美丽胡枝子子叶节为外植体,通过与含有植物双元表达载体pKP的农杆菌LBA4404 共培养,将Sac B 基因导入美丽胡枝子基因组。经卡那霉素筛选后,共获得62 株卡那霉素抗性植株。经PCR特异性扩增和PCR-Southern杂交,证明有5株再生植株基因组DNA 中整合了Sac B 基因。通过RT-PCR分析,结果表明SacB 基因均获得表达。经过200 mmol/L NaCl和5% PEG模拟胁迫,发现转基因植株美丽胡枝子中,可溶性糖含量在任何时候均高于未转化植株,并比对照拥有更高的抗干旱胁迫和盐胁迫能力。     

胸腺肽基因对樱桃番茄的遗传转化

胸腺肽基因是一343bp的小肽基因,是从动物中克隆得到的。本文以“美味樱桃”番茄为植物材料,用农杆菌侵染法进行了胸腺肽基因的遗传转化。对所得再生植株进行了PCR和Southern blot检测及RT-PCR检测,34棵Kam抗性株通过目的基因PCR检测,4棵为阳性株,阳性株率为11．8%。实验中还对目的基因之后的Nos终止序列区进行了扩增,通过Nos Ter．引物对4株目的基因PCR阳性株作PCR检测．只有1株为阳性株,该植株经Southern blot检测和RT-PCR检测,均为阳性。这些检测结果说明胸腺肽基因成功地整合到番茄基因组中,并在转录水平上得以表达。     

红树林耐盐相关基因转化水稻的研究

运用农杆菌介导法将红树林耐盐相关基因mangrin转入粳稻品种‘日本晴’中,通过GUS基因检测愈伤组织转化率,确定农杆菌菌液浓度OD600为0.5,浸染时间30min,共培养时间3d为最佳转化体系;经潮霉菌筛选,获得抗性再生植株。通过PCR扩增检测、Southern blot分析和GUS基因活性检测,结果表明,mangrin基因整合到再生水稻的染色体DNA上。耐盐性测定结果表明,转基因植株在200mmol/L NaCl胁迫下,成活率保持在83.3%,株高增长20%~40%,mangrin基因能提高转基因水稻对盐胁迫的抗性。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达

质粒pLS9含有1．5kb的编码菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因。经限制酶切后克隆到植物表达载体的35S启动子和PolyA终止子之间。经农杆菌介导转化烟草,获得90多株抗卡那霉素再生植株。经PCR检测证明60％以上再生植株含有BADH基因。转基因植株经Western blot,BADH酶活性测定,BADH酶活性特异性染色法检查和耐盐性分析,证明菠菜BADH基因在烟草正常表达。在叶绿体和胞液中均有BADH酶存在。转基因植株能耐较高浓度盐。     

菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究

通过PCR从苋属植物千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜凝集素(AHA)的核基因片段。序列分析结果表明该基因为2453bp,含有一1538bp的内含子和两个分别为212bp和703bp的外显子。采取反向PCR的方法获得仅含该基因的编码区克隆。以此为基础与二元表达载体pBin438构建含内含子与不含内含子AHA基因的植物表达载体pBAHAg和pBAHAc并通过土壤农杆菌介导转化了烟草。转化再生植株的PCR和Southern blot分析表明,AHA基因已整合到烟草的染色体中,有单拷贝和多拷贝的整合。用与AHA蛋白高度同源的ACA蛋白的抗血清进行了免疫斑点(Immunodot blot)检测,结果初步表明转基因烟草有AHA蛋白的表达。虫试结果表明转pBAHAg和pBAHAc烟草对蚜虫的平均抑制率分别达57.2%和48.8%,有的高达90%以上。含内含子和不含内含子的AHA基因在转基因植株中的抗蚜性不同。     

定点整合抗虫基因到油菜叶绿体基因组并获得转基因植株

以基因枪法进行了油菜叶绿体基因组的定点转化,载体pNRAB携带抗壮观霉素的筛选标记基因aadA和抗虫基因cry1Aα10,基因的两侧被添加了可用于同源重组的叶绿体DNA序列,基因枪轰击过的油菜子叶柄经植株再生和壮观霉素筛选,获得了36株抗性植株,PCR检测和Southern杂交显示,其中4株的叶绿体基因组已被转化,外源基因已被定点整合进叶绿体基因组的rps7和ndhB基因之间。用转基因植株的叶片饲喂二龄小菜蛾,1周后幼虫死亡率达33%-47%,存活幼虫的生长明显减慢,转基因油菜的叶片受害较轻。