基因打靶技术在模式植物小立碗藓的应用

介绍了基因打靶技术在新型模式植物小立碗藓(Physcomitrella patens)中的应用.     

植物分子生物学研究极具前景的模式系统--小立碗藓

小立碗藓作为植物分子生物学研究极具前景的模式系统已日益受到人们的重视,它的生活史周期短,易于培养,转基因植株易于分析,核基因组容易和外源DNA发生同源重组,这些特点使它成为研究基因功能的良好材料.一些成功的基因敲除和基因破坏已经在小立碗藓中实现,这些基因的功能也通过小立碗藓转化植株的特点得以证实.小立碗藓标签突变文库已经建立,其应用为小立碗藓基因的进一步研究打下了基础.关于小立碗藓的ESTs数据库已经建立,已有67 000条ESTs信息.     

植物分子生物学研究极具前景的模式系统——小立碗藓

小立碗藓作为植物分子生物学研究极具前景的模式系统已日益受到人们的重视,它的生活史周期短,易于培养,转基因植株易于分析,核基因组容易和外源DNA 发生同源重组,这些特点使它成为研究基因功能的良好材料。一些成功的基因敲除和基因破坏已经在小立碗藓中实现,这些基因的功能也通过小立碗藓转化植株的特点得以证实。小立碗藓标签突变文库已经建立,其应用为小立碗藓基因的进一步研究打下了基础。关于小立碗藓的ESTs 数据库已经建立,已有67 000 条ESTs 信息。     

有前景的模式植物小立碗藓的研究新进展

小立碗藓是在分子生物学研究方面有广阔应用前景的模式植物。该文主要综述了有关小立碗藓在功能基因组学、进化和适应性及植物生理等方面最新的研究进展。     

模式生物小立碗藓遗传转化系统的研究进展

苔藓植物小立碗藓是迄今发现的同源重组率最高的陆生植物,堪与酵母媲美,具有"绿色酵母"之称。高的同源重组频率、简单的发育模式以及单倍体配子体为主的生活史使其渐渐成为研究生物学进程和发育模式的新型模式生物。现对近年来小立碗藓遗传转化系统研究的进展进行总结和分析,为相关研究工作者充分利用这一体系提供帮助。对小立碗藓遗传表达系统的载体构建、转化方法及宿主细胞准备等方面的进展进行了综述,对小立碗藓在基因打靶方面的应用进行了简要总结。     

小立碗藓（Physcomitrella patens）植物microRNA结合靶位预测

利用857条植物miRNA序列对27546条小立碗藓mRNA序列进行搜索,预测出162个植物miRNA家族在小立碗藓中存在结合靶位。miRNA结合靶位数目和miRNA协同作用网络分析结果同时显示,miR482和miR1168在小立碗藓中结合靶位多、协同作用广,提示它们对于小立碗藓可能具有重要生物学功能。52个菜茵衣藻特有的miRNA被预测在小立碗藓中存在结合靶位,显示小立碗藓在从藻类向种子植物进化过程中处在独特演化位置。     

小立碗藓愈伤组织诱导和培养

小立碗藓已经成为植物功能基因组学的模式系统,其材料的大量培养是所有工作的基础.文章探讨了小立碗藓愈伤组织诱导和组织培养的基本条件,并观察了小立碗藓愈伤组织的亚显微结构.     

小立碗藓属在中国的记录

本文作者在湖南张家界采得小立碗藓属植物,经扫描电镜显示,其孢子具多数柱状疣的特征与小立碗藓加利福尼亚亚种相一致,可确定它为P．patens(Hedw．)B．S．G．subsp．californica(Crum et Anderson)Tan。此为小立碗藓属植物在我国的首次记录。     

植物基因打靶研究现状

基因打靶是八十年代后期发展起来的一门新兴的遗传工程技术,基因打靶在探索生物的基因功能,消除转基因的沉默,提高转基因的稳定性和表达效率以及基因治疗等方面的均取得了进展,基因打靶技术的前景广阔,它的产生是遗传工程领域的一次革命。目前,基因打靶在植物上的应用研究才刚起步。本文针对基因打靶在植物上的研究现状作一综述。     

小立碗藓LysM型类受体激酶基因家族生物信息学分析

植物LysM型类受体激酶(lysin motif receptor-like kinase,LYKs)是植物中发现的一类重要的RLK,在植物生长发育、抵御逆境胁迫等方面具有不可忽视的作用,是植物中基因功能的研究热点。为更好地了解小立碗藓中的LYK基因,该文利用生物信息学的方法对小立碗藓(Physcomitrella patens) LysM型类受体激酶基因家族成员进行鉴定及分析。通过分析小立碗藓LYK家族成员的基本物理信息、基因结构、染色体定位及系统发生关系,初步探讨了其LYK基因结构、进化与功能间的联系。结果表明:(1)小立碗藓中共有21个LYK基因,其氨基酸序列大小在625～755 aa之间,分子量为69.54～82.02 kDa,等电点在5.98～7.78之间。(2)将小立碗藓所有LYK蛋白与3种典型模式植物(水稻、拟南芥和蒺藜苜蓿)的LYK蛋白共同构建系统进化树,所有LYK蛋白被分为4个亚组(LYK-I、LYK-Ⅱ、LYR-I和LYR-Ⅱ)。小立碗藓各亚组内成员的基因结构、保守域特征显示出较为相似的特征,由此推测其可能具有相同或相似的功能。(3)染色体定位发现21个LYK基因集中分布于4条染色体上并出现小型基因簇,这可能与基因功能相联系。该文分析了小立碗藓LysM型类受体蛋白激酶基因家族的基本信息,可为后续深入研究其LYK基因家族成员的生理生化功能奠定基础。     

小立碗藓扩展蛋白基因家族的鉴定与生物信息学分析

扩展蛋白(Expansins,EXP)是一类基因家族,几乎参与了植物发育的全过程,从种子萌发到果实成熟都有扩展蛋白的参与。该研究利用生物信息学的方法对小立碗藓(Physcomitrella patens) Expansin基因家族成员进行鉴定,分析了其基因结构、染色体定位以及系统发生关系。结果表明:小立碗藓基因组中含有Expansin A(EXPA) 32个、Expansin-like A(EXLA) 6个,并未发现Expansin-like B(EXLB)及Expansin B(EXPB)。扩展蛋白氨基酸序列长度在228～290 aa之间,编码蛋白质具有两个保守的结构域Pollen_allerg_1和DPBB_1。蛋白质亚细胞定位预测结果表明:运用CELLO在线工具预测发现小立碗藓中约4/5的EXP家族基因定位于细胞外;而Euk-mPLoc预测结果则显示小立碗藓EXP基因家族成员全定位于细胞外。基因结构分析表明,小立碗藓中约68%Expansin基因有含有1～3个内含子。以上结果可为深入研究小立碗藓扩展蛋白基因的分子进化与生物学功能奠定基础。     

基因定点整合技术及其在苔藓研究中的进展

基因定点整合技术是20世纪80年代后兴起的一种分子生物学技术,在精细研究基因功能,消除转基因沉默,基因治疗等有重要意义。基因定点整合技术是功能基因组学研究的重 要手段。目前关于基因定点整合技术在酵母和鼠胚胎干细胞中的应用已经很成熟,高等植物 由于同源重组频率较低而限制了它的应用,但小立碗藓（Physcomitrella patens）基因同源重组频率较高,基因定点整合技术得到了成功应用,可望成为一种新的分子生物学的模式植物。本文针对基因定点整合的原理、技术路线及进展作一综述。     

小立碗藓对重金属镉胁迫的应答特征

镉是植物非必需的微量重金属元素, 镉胁迫引起植物细胞的代谢紊乱, 甚至导致细胞死亡。为了探索苔藓植物对镉胁迫的应答机制, 采用高通量测序及生物信息学技术分析了藓类模式植物——小立碗藓(Physcomitrella patens)在镉胁迫下的基因表达特征。结果表明, 在镉胁迫下, 小立碗藓细胞骨架组织、微管运动、DNA修复系统、端粒维护、配子体形成与有性生殖以及与氮代谢等相关基因的表达具有明显的镉胁迫应答特征, 暗示了这些基因可能共同参与小立碗藓对镉胁迫的调控反应。该研究结果为阐明植物对镉胁迫的应答机制提供了新的线索。     

小立碗藓PpAGO7基因启动子分离及其启动活性分析

AGO7蛋白在多种植物中被发现并预测在叶片生长发育过程中起作用,但是在高等植物中最古老且唯一没有维管束的苔藓植物中却未有报道。该文通过BLAST比对水稻OsAGO7基因编码的氨基酸序列得到小立碗藓AGO7蛋白编码基因PpAGO7,扩增PpAGO7基因起始密码子上游的启动子序列,利用在线软件PlantCARE和PLACE分析该启动子的结构特征;并构建启动子分析载体pPpAGO7-GUS,转化拟南芥,通过转基因拟南芥GUS染色结果分析推测PpAGO7启动子的启动特性。结果显示:(1)PpAGO7基因启动子序列中含有大量的光反应有关的顺式作用元件以及数个分生组织相关和防御与胁迫相关作用元件。(2)T2代转基因拟南芥的GUS染色结果表明,PpAGO7基因启动子会启动GUS在拟南芥的不同部位和不同生长时期表达,而且在根尖、叶片顶端、雄蕊的花药、雌蕊的柱头和种子等部位的染色较其他部位更深。(3)生长在光照强度1 000lx和4 000lx下转基因拟南芥的GUS酶活性比光照强度7 000lx和10 000lx下的低。研究表明所克隆的PpAGO7基因启动子具有组成性启动活性,且在生长旺盛的部位启动活性较强,此外其启动活性还受到光照因素的影响,为进一步研究小立碗藓的PpAGO7基因功能提供了重要依据。     

植物基因打靶研究现状

基因打靶是八十年代后期发展起来的一门新兴的遗传工程技术,基因打靶技术在探索生物的基因功能,消除转基因的沉默,提高转基因的稳定性和表达效率以及基因治疗等方面均取得了进展。基因打靶技术的应用前景广阔,它的产生是遗传工程领域的一次革命。目前,基因打靶在植物上的应用研究才刚起步。本文针对基因打靶在植物上的研究现状作一综述。     

植物的基因打靶

对拟南芥、苔藓等几种模式植物基因打靶的研究新进展作了概述,并对目前基因打靶领域的一些新技术(如含有重组酶和稀有限制性内切酶的基因打靶载体技术、异源重组基因的过表达技术、参与重组酶的基因突变技术、寡核苷酸诱导的基因打靶技术等)作了介绍.     

小立碗藓WRKY基因家族生物信息学分析

WRKY作为最先在植物中发现的转录因子,在植物生长发育等过程中发挥重要作用。为了更好地研究小立碗藓WRKY蛋白的结构与功能,该文以Pfam数据库中WRKY基因家族数据(登录号为PF03106)为材料,分析了小立碗藓(Physcomitrella patens)WRKY基因家族成员的理化性质、蛋白质的二级结构预测、染色体定位、内外显子分布及系统进化关系。结果表明:(1)小立碗藓WRKY基因家族成员共有38个基因,根据WRKY保守结构域个数和锌指结构类型分成Ⅰ、Ⅱ两大类,不含第Ⅲ类(锌指结构为C2HC型),其中部分基因WRKY保守结构域发生变异。(2)WRKY蛋白氨基酸长度在216~775 aa之间、相对分子质量在24.5~82.8 kDa之间,亚细胞定位显示WRKY家族成员蛋白质定位于细胞核中。(3)WRKY蛋白的二级结构以α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲四种构成元件构成,除PpWRKY11(α-螺旋为主)外,其余无规卷曲占比高达70%。(4)与拟南芥的系统进化关系表明,植物在进化过程中WRKY家族成员的数目与进化方式发生改变,WRKY基因家族成员外显子的个数为3~7个。(5)小立碗藓WRKY基因家族成员无规则分散于21条染色体上,并未形成基因簇。该研究通过分析WRKY基因家族的基本结构与性质,能为后续深入研究WRKY转录因子的功能奠定基础。     

小立碗藓萜类物质的合成酶基因分析及其UPLC-QTOF检测

根据基因组信息和KEGG数据库分析小立碗藓基因组中合成萜类物质的基因,比较小立碗藓与酵母和拟南芥合成萜类物质基因的氨基酸序列同源性同时利用UPLC-QTOF分析小立碗藓中物质组成,来分析小立碗藓基因组中萜类物质合成的基因及小立碗藓中存在的萜类物质。与酵母相比,小立碗藓两条萜类次生代谢途径完整,途径中的基因及氨基酸丰富性更高,提示可以合成更丰富的前体物质如FPP,GPP等;小立碗藓与拟南芥的序列相似性较高,萜类背景简单。UPLC-QTOF分析检测到小立碗藓中次生代谢物质主要是芳香族化合物及各类生物碱,一种萜类物质ent-16beta-Methoxy-19-kauranoic acid。小立碗藓中本身具有合成萜类前体物质和二萜的基因,检测到少量萜类物质,适合作为萜类活性物质异源合成的底盘细胞。     

紫杉醇组合生物合成的研究进展

紫杉醇是植物次级代谢产物中一种具有抗癌作用的萜类物质。但由于在自然界中含量低、难获得使其成本昂贵,临床应用受限。近年来,利用组合生物合成技术制备紫杉醇成为研究热点,研究用的体系以大肠杆菌、酵母为主,还涉及到小立碗藓、拟南芥、番茄、人参等植物体系。文中综述了不同体系中紫杉醇的组合生物合成研究进展,分析了目前存在的问题,并对不同体系的发展方向提出建议。最后,结合本实验室对紫杉醇组合生物合成的小立碗藓体系的研究,阐述了其发展前景和优势。     

小立碗藓MADS-box基因家族的系统进化分析

苔藓植物作为最早出现的陆生植物的代表,生活周期仍以配子体为主,在植物进化史上占据着重要的地位。另外,同源异型基因MADS-box家族广泛参与植物的生长发育和形态构建。因此,对苔藓植物MADS-box家族的分析有助于了解苔藓植物出现过程中发生的重要分子事件和关键器官革新。我们基于最新公布的小立碗藓基因组数据库确定了20个带有典型MADS结构域的MADS-box基因,其中11个MIKC~*型、5个MIKC~C型、4个I型,并对它们进行了染色体定位、外显子-内含子基因结构、蛋白结构域组成、系统进化构建等分析,为进一步阐明小立碗藓MADS-box基因的功能提供了准确的信息资源。