甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

蜜蜂残翼病毒TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

蜜蜂残翅病毒(Deform wing virus,DWV)已成为世界上最著名、分布最广、研究最为深入的昆虫病原.虽然DWV以前存在于蜜蜂种群中,但一种新的媒介一外寄生螨Varroa破坏体的到来和全球传播,极大地促进了 DWV的流行病学.为了建立快速、准确且能定量分析的蜜蜂残翅病毒,DWV检测方法,本研究参照GenBank中已登录的DWV高度保守的3C-RdRp基因区域,设计了 1对特异性引物和带有羧基荧光素(Fast Auxiliary Memory,FAM)与淬灭基团(Eclipse)标记的TaqMan探针,并对反应条件进行优化,建立了检测DWV的TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法(TaqMan qRT-PCR),同时对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行了试验,并对临床样品进行检测.结果显示:该方法最佳上下游引物和探针浓度分别为12.5μmol/L和10μmol/L,最佳退火温度为59℃;敏感性试验中,对DWV质粒标准品检测下限为2.58×101拷贝/μL;本方法特异性较好,对蜜蜂常见病毒-蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、蜜蜂急性麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)和中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)无交叉反应;且批内变异系数和批间变异系数均小于2％.利用该方法对49份临床疑似样本进行检测,其中DWV阳性样本为35份,检出率高于常规RT-PCR方法,且病毒载量大于1×107拷贝/只样本数共24份,表明辽宁和河北部分地区感染DWV蜂群中病毒载量较高,流行情况比较严重.因此,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,能够用于DWV病原监测、流行病学调查和病毒定量分析等相关研究.     

应用改良的实时TaqMan荧光定量 RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平

将改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术应用于口蹄疫病毒感染体内和体外的定量检测以及其3D基因转录水平分析.结果表明对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达l0个基因拷贝,可同时检测病毒正负链复制水平且重复性较好,所测口蹄疫病毒3D基因转录水平可高达6.9×104拷贝/μL;与实时SYBR GreenⅠ染料RT-PCR技术比较,改良的实时TagMan荧光定量RT-PCR技术检测灵敏度高6.7倍.以上结果证实,改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术在病毒检测和基因表达水平分析方面有更高的灵敏度和特异性.     

应用改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术检测口蹄疫病毒及其3D基因转录水平

将改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术应用于口蹄疫病毒感染体内和体外的定量检测以及其3D基因转录水平分析。结果表明:对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达l0个基因拷贝,可同时检测病毒正负链复制水平且重复性较好,所测口蹄疫病毒3D基因转录水平可高达6.9×104拷贝/μL;与实时SYBRGreenⅠ染料RT-PCR技术比较,改良的实时TagMan荧光定量RT-PCR技术检测灵敏度高6.7倍。以上结果证实,改良的实时TaqMan荧光定量RT-PCR技术在病毒检测和基因表达水平分析方面有更高的灵敏度和特异性。     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

琉球病毒、索尔韦齐病毒、苏里斯病毒等三种沙粒病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

建立可检测琉球病毒(Ryukyu virus,RYKV),索尔韦齐病毒(Solwezi virus,SOLV)以及苏里斯病毒(Souris virus,SOUV)等三种沙粒病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法.分析三种病毒流行病学分布特征,从国际公共数据库搜索下载基因组序列,进行比对分析,确定检测靶标,借助primer premier 6.0生物信息学软件,设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,利用化学合成和体外转录方法制备模拟样本,比较评价三种方法的检测限、特异性、重复性特征.所建实时荧光定量RT-PCR检测方法均可有效扩增检测病毒RNA靶标,检测限分别为40拷贝/μL、7拷贝/μL和15拷贝/μL,检测汉城病毒、汉滩病毒、登革病毒Ⅰ～Ⅳ型分离株、发热伴血小板减少综合病毒及30份健康人血清样本无非特异性扩增,三种病毒相互间以及其他8种出血热相关沙粒病毒RNA间无交叉反应,重复性比较分析显示变异系数均在2％以内.本研究建立的检测RYKV、SOLV和SOUV三种沙粒病毒的实时荧光RT-PCR方法具备用于相关疑似感染者临床样本、宿主动物标本以及进出口物品的筛查检测的潜力,但因未经基于实际病毒感染样本的比较评价,检测结果的解释仍具有一定的局限性.     

猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

检测蜜蜂急性麻痹病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立和初步应用

[背景] 蜜蜂急性麻痹病毒（Acute Bee Paralysis Virus,ABPV）是一种高毒力的蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的大批死亡和蜂群衰竭。[目的] 建立一种快速、灵敏的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法。[方法] 根据ABPV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和探针,通过对引物、探针浓度和退火温度等反应条件进行优化,建立基于TaqMan探针检测ABPV的实时荧光RT-PCR方法,并对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行验证。[结果] ABPV实时荧光RT-PCR检测方法在9.8×10¹-9.8×10⁸ copies/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R²为0.998,扩增效率为103.8%。该方法的检测灵敏度为9.8 copies/μL;对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别为0.19%-0.80%和0.57%-1.07%,重复性良好。对2018年-2019年在福建地区采集的70份蜜蜂样品进行ABPV检测,阳性率为2.86%。[结论] 建立的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法能用于该病的实验室检测、流行病学调查和疫情监测。     

基于TaqMan探针的蜜蜂囊状幼虫病病毒荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立快速有效的蜜蜂囊状幼虫病检疫方法, 依据TaqMan荧光标记探针技术原理, 针对蜜蜂囊状幼虫病病毒保守序列, 设计出一对特异性引物和一条探针, 建立了一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病病毒的荧光PCR方法。该方法对蜜蜂囊状幼虫病的检测具有较好的特异性, 与蜜蜂急性麻痹病病毒、蜜蜂慢性麻痹病病毒、蜜蜂残翼病病毒和黑蜂王台病病毒之间均无交叉反应。检测灵敏度可达1.0×10²拷贝/μL阳性质粒, 可对低病毒含量的样品进行准确检测。重复性和稳定性试验结果显示, 变异系数为1.6%, 说明该方法具有较好的重复性和稳定性。应用该方法对蜜蜂及蜂制品进行检测, 结果显示所建立的荧光PCR检测方法4 h内即可报告检测结果, 该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等优点, 适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂囊状幼虫病病毒的快速检疫。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.