百合查尔酮合成酶基因克隆及其转化烟草的花色表达分析

以‘西伯利亚’百合为试材,利用PCR技术克隆了查尔酮合成酶基因(CHS),构建了CHS基因的正义和反义植物表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草叶盘,获得了转正义CHS基因的本明烟草18株,转反义CHS基因的普通烟草21株,总转化率为26.0%。高效液相色谱法(HPLC)检测结果显示,正义CHS转基因的本明烟草类黄酮含量升高14.0%～59.7%,反义CHS转基因的普通烟草类黄酮含量降低44.5%～76.4%。花色观察结果显示,正义转基因烟草的花瓣颜色未见变化,反义转基因烟草部分植株的花瓣颜色变浅。研究表明,CHS基因遗传转化是进行花色调控的有效手段之一。     

UGPase和反义4CL基因对转基因烟草纤维素和木质素合成的调控

用根癌农杆菌介导法将源于紫穗槐的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因、反义4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）基因以及两者的双价基因分别转移至烟草中。PCR和Southern杂交检测证实外源基因已整合到转基因烟草基因组中。测定全纤维素和Klason木质素含量的结果显示,增强UGPase基因的表达可提高转基因植株的纤维素含量,但对木质素含量没有影响;抑制4CL基因的表达可显著降低转基因植株的木质素含量,但对纤维素含量没有影响;转移双价基因的转基因植株中纤维素含量增加而木质素含量降低。     

金花茶查尔酮合成酶基因CnCHS的克隆及遗传转化研究

根据已发表的金花茶查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因(CnCHS)序列设计全长扩增引物,以金花茶花瓣总cDNA为模板进行PCR扩增,成功获得了该基因cDNA全长。将扩增所得全长产物连接PMD18-T载体后转化大肠杆菌E.coli DH5α,提取质粒后经酶切、测序鉴定后,将其与双元表达载体pCAMBIA1300连接,成功构建了CnCHS基因的正义表达载体pCAM-CnCHS。将该重组表达载体转化农杆菌EHA105后,利用农杆菌介导法将CnCHS基因转入烟草,获得转基因烟草18株。利用PCR法及Southern blotting对所获得的转基因植株进行鉴定,结果显示CnCHS基因成功整合到烟草基因组中,阳性率达67%,并获得了单拷贝转基因植株。这些结果表明本研究成功构建了金花茶CnCHS基因对烟草的遗传转化体系,为深入研究CnCHS基因的功能及其对花色的调控效应奠定了基础。     

2个石榴品种果皮花色苷合成相关基因表达分析

以2个不同红色石榴品种‘红宝石’和‘墨石榴’为试验材料,采用荧光定量PCR方法,分析花色苷合成相关基因CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT等6个基因在果实发育过程中的转录表达特性,同时分析基因表达量与果皮花色苷积累的关系。结果表明:(1)在整个果实发育期内‘墨石榴’花色苷含量明显高于‘红宝石’;随着果实的发育,‘红宝石’果皮中总花色苷含量不断增加,而‘墨石榴’中总花色苷含量初期很高,随后迅速下降,后期维持在较低水平。(2)‘红宝石’中CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT等5个基因均在果实发育的早期和晚期出现2个表达高峰,而ANS基因的表达量在整个果实发育期内不断升高;在‘墨石榴’中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等5个基因的表达高峰均出现在早期,随着果实的发育表达量均呈下降变化趋势,但UFGT基因在中期时表达量最高。(3)‘红宝石’石榴的ANS基因表达量与总花色苷含量呈显著正相关,‘墨石榴’中CHS和ANS基因的表达水平与总花色苷含量显著相关。研究认为,花色苷合成相关基因的初期和末期表达差异是2个石榴品种着色差异的主要原因,ANS在‘红宝石’着色中起关键作用,CHS和ANS可能在‘墨石榴’花色苷积累中起重要作用。     

葡萄果实成熟期花色苷与白藜芦醇合成相关基因的表达

以酿酒葡萄‘赤霞珠’为试材,采用pH示差法和高效液相色谱(HPLC)法分别测定葡萄成熟期果皮花色苷和白藜芦醇含量,用实时荧光定量PCR检测两者合成途径中相关基因的表达量,分析花色苷含量和白藜芦醇含量与其相关基因表达的关系,以揭示结构基因与调控基因的调控机制,为筛选富含花色苷和白藜芦醇的酿酒葡萄提供理论依据。结果显示:(1)葡萄果皮花色苷含量在花后112d达到最高值(0.77mg/g),反式白藜芦醇含量在花后126d达到最高值(30.87μg/g)。(2)花色苷和白藜芦醇合成途径中,CHSs、CHI、STS、UFGT、MybA1、MybA2基因的表达量除花后98d下调外,其余时间均呈上调表达,而Myb5a则始终呈上调表达。(3)相关分析表明,STS基因表达量与CHS1、CHS2基因表达量呈极显著和显著正相关关系,MybA1、MybA2基因表达量与CHSs、CHI、STS、UFGT基因的表达量呈极显著正相关关系;Myb5a基因表达量与CHS3基因表达量呈极显著正相关关系。研究表明,部分结构基因的表达与花色苷和白藜芦醇的变化不同步,MybA1和MybA2可能调控花色苷合成途径中多个结构基因的表达,花色苷与白藜芦醇的关系并不固定,而是处在动态变化中。     

石榴果色合成相关基因CHS和CHI的表达特性分析

花色苷是类黄酮家族中重要的一类次生代谢产物,对果实呈色起重要作用。CHS (查尔酮合成酶)和CHI (查尔酮异构酶)为花色苷合成提供了前体物质,是花色苷合成所不可或缺的。利用RT-PCR和RACE方法,本研究从石榴果皮中克隆了与花色苷合成相关的CHS基因和CHI基因的cDNA全长,同时采用qRT-PCR研究了这两个基因在三个不同色泽石榴品种‘红宝石’、‘水晶甜’、‘墨石榴’发育期内的表达模式,并分析了果皮花色苷含量变化与基因转录水平的关系。结果表明,石榴中CHS和CHI基因cDNA全长分别为1 197 bp和693 bp,分别编码398和230个氨基酸,命名为PgCHS和PgCHI,在GenBank中的登录号分别为KF841615和KF841616。在氨基酸水平上,Pg CHS与荔枝、葡萄、山竹等果树的同源性达到90%以上。Pg CHI与果树中龙眼、梨、美洲葡萄、桑树等同源性达到70%以上。qRT-PCR结果显示,CHS和CHI基因的表达模式随色泽发育期和品种不同而有差异。在‘红宝石’石榴中,该两个基因都有前期和后期两个表达高峰期;而‘水晶甜’石榴中这两个基因的表达高峰期均出现在中后期;‘墨石榴’发育初期时CHS和CHI的表达量最高,以后的表达量都较低。同一品种内,CHS和CHI的表达具有协同性,两者的协同性表达有利于花色苷及其他类黄酮相关产物的合成。3个品种中CHS和CHI基因的表达与花色苷的积累并不一致。     

转星星草金属硫蛋白基因烟草的获得及其抗重金属镉能力分析

用农杆菌介导法将星星草金属硫蛋白基因（MD转化烟草,PCR及PCR—Southern检测的结果表明,该基因已导入烟草中。Real-TimePCR检测显示,该基因在转基因后代中的转录水平高于非转基因植株。Cd2＋胁迫下,转基因植株能够正常生长,鲜重、株高、叶绿素含量、Cd2＋含量和SOD活性均高于非转基因植株,表明MT基因的过量表达可提高转基因烟草的抗Cd2＋能力。     

铁蛋白基因表达对烟草耐低铁能力的影响

铁是植物生长发育的必需元素。由于土壤中的三价铁离子不能被植物直接利用。使一些植物经常表现出缺铁症状。为探讨利用铁蛋白基因提高植物耐低铁胁迫的作用,利用农杆菌介导法将大豆铁蛋白基因SoyFer1和内源反义铁蛋白基因NtFer2的cDNA分别导人烟草基因组,采集转基因烟草种子。对T1转基因烟草的卡那霉素抗性分析表明,整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因,也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到烟草基因组中,并且得到了正确表达。将转基因株系移栽到铁离子浓度不同的培养基中生长2个月后进行比较表明,转大豆铁蛋白基因烟草株系的生长量明显高于非转基因烟草株系,而转内源反义铁蛋白基因烟草株系的生长量则明显低于非转基因烟草株系。转大豆铁蛋白基因和转内源反义铁蛋白基因烟草株系的叶绿素含量、丙二醛（MDA）含量和过氧化物酶（POD）活性等生理性状也发生了明显变化,表现为转大豆铁蛋白基因株系的叶绿素含量明显增加,POD活性明显增强,MDA含量明显降低：而转内源反义铁蛋白基因株系的叶绿素含量、POD活性和MDA含量等则表现为与转大豆铁蛋白基因株系的相反。铁蛋白过量表达提高了烟草耐低铁能力,而铁蛋白抑制表达则降低了烟草耐低铁能力。     

铁蛋白基因表达对烟草耐低铁能力的影响

铁是植物生长发育的必需元素。由于土壤中的三价铁离子不能被植物直接利用, 使一些植物经常表现出缺铁症状。为探讨利用铁蛋白基因提高植物耐低铁胁迫的作用, 利用农杆菌介导法将大豆铁蛋白基因SoyFer1和内源反义铁蛋白基因NtFer2的cDNA分别导入烟草基因组, 采集转基因烟草种子。对T1转基因烟草的卡那霉素抗性分析表明, 整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因, 也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR检测和Northern杂交分析表明, 外源基因已整合到烟草基因组中, 并且得到了正确表达。将转基因株系移栽到铁离子浓度不同的培养基中生长2个月后进行比较表明, 转大豆铁蛋白基因烟草株系的生长量明显高于非转基因烟草株系, 而转内源反义铁蛋白基因烟草株系的生长量则明显低于非转基因烟草株系。转大豆铁蛋白基因和转内源反义铁蛋白基因烟草株系的叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)活性等生理性状也发生了明显变化, 表现为转大豆铁蛋白基因株系的叶绿素含量明显增加, POD活性明显增强, MDA含量明显降低; 而转内源反义铁蛋白基因株系的叶绿素含量、POD活性和MDA含量等则表现为与转大豆铁蛋白基因株系的相反。铁蛋白过量表达提高了烟草耐低铁能力, 而铁蛋白抑制表达则降低了烟草耐低铁能力。     

转柽柳晚期胚胎富集蛋白基因烟草的耐低温性分析

目的:验证转柽柳晚期胚胎富集蛋白(LEA蛋白)基因烟草对低温的忍耐程度。方法:采用低温方式,对转LEA蛋白基因烟草的11个株系及非转基因对照烟草组培苗和大棚盆栽苗进行胁迫处理,测定其相对电导率和丙二醛含量。结果:烟草组培苗在非胁迫条件下,转基因和非转基因对照烟草的相对电导率、丙二醛含量无显著差异;在0℃胁迫条件下,非转基因对照烟草的相对电导率和丙二醛含量均明显高于转基因烟草。大棚盆栽烟草在-4℃条件下,各转基因烟草的相对电导率、丙二醛含量与0℃胁迫时均变化不大;但非转基因对照烟草相对电导率高于0℃胁迫的25.2%,丙二醛含量高于0℃胁迫的59.29%。结论:柽柳LEA蛋白基因的导入提高了烟草的耐低温能力。     

云南红豆杉紫杉烯合成酶基因克隆、序列分析与植物表达载体的构建

利用分段RT—PCR法成功地从云南红豆杉叶片总RNA中分离出两条长约1．4kb和1．5kb的cDNA片段,克隆到pUCm—T载体中,序列拼接分析表明,该cDNA片段与Wildung MR等发表的紫杉二烯合成酶基因编码区2586bp有41个核苷酸不同,同源性为98．42％,具有编码862个氨基酸蛋白质的能力．为了检测所克隆的基因编码产物是否具有活性,并进一步制备抗体以便于将来转基因植物的检测,构建了一个酵母表达载体GAPA-T14;为了转化植物构建了两个具有不同启动子的植物表达载体,pBI121-T14(含35S启动子)和pBIH-T14(在pBI121的基础上以胶乳特异启动子取代35S启动子)．     

香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建

从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片 ,获得香蕉花叶病毒 ,提纯其 RNA,在 AMV反转录酶作用下合成 c DNA第一链 ,经 PCR扩增 ,获得一约 70 0 bp的 DNA片段 ,测序结果显示所克隆的 DNA片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系 ( CMV-BHI)外壳蛋白基因 ,长度为 6 5 7bp,然后将此 DNA片段 ,分别克隆到p BI1 2 1和 p KHG4质粒 ,构成两个含 Ca MV35 s启动子 ( 5 '-端 )、NOS终止子 ( 3'-端 )和分别含 NPT 标记基因和 NPT 及 HPT标记基因的植物表达载体 ( p TBB和 p TBK)。然后用 p AHC1 8中的 UBI promoter换下p BI1 2 1的 Ca MV35 s promoter,构成 p BIAH;再用 CMV-BHI外壳蛋白基因换下 p BIAH中 GUS基因 ,构成一含单子叶植物启动子 UBI和 NPT 标记基因的植物表达载体 ( p TBBU)。从而为 CMV-BHI外壳蛋白基因在香蕉中表达打下了基础     

橡胶树白粉菌(HO-73)启动子WY172不同长度片段的克隆及表达活性分析

旨在克隆橡胶树白粉菌启动子WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段,以分析启动子各片段的表达活性。基于实验室前期研究基础,以WY172上游2K序列作为研究对象进行渐变缺失突变,得到4个不同长度的可能具有启动子活性的片段,结合WY172,选用pBI121载体作为骨架,分别替换GUS基因前的CaMV35S启动子,并分别构建重组表达载体,通过ATMT法转化农杆菌;利用GUS染色法和酶活性检测,分析WY172启动子及不同长度片段的酶活性。分别构建了pBI121-WY172、pBI121-WY172Q、pBI121-WY172Q1、pBI121-WY172Q2、pBI121-WY172Q3共5个重组的植物表达载体,所有植物表达载体烟草瞬时表达GUS染色均有蓝色出现,且蓝色程度均强于阳性对照CaMV35S启动子,其中pBI121-WY172Q3的GUS染色相对最深;GUS酶活性测定结果显示所有缺失突变片段都具有调控基因表达的启动子活性,且启动活性均强于CaMV35S启动子,WY172Q3调控GUS基因表达的活性最高。因此我们判断WY172及其上游2K序列上4个不同长度缺失片段均具有启动子活性,其中以WY172Q3启动子片段的表达活性最强。     

拟南芥冷诱导型启动子CBF 3的克隆及活性检测

目的：构建冷诱导型启动子CBF3基因的植物表达载体,并将其转入烟草。方法：以拟南芥基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆冷诱导表达启动子CBF3（C-repeat binding factor）。用CBF3启动子替换pBI121载体上的35S启动子构建新的载体pBC-GUS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。结果：获得了转基因烟草,转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温诱导下,CBF3启动子可增强GUS基因表达。结论：CBF3启动子可应用于植物抗冷基因工程研究。     

ggpps 5'-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的:研究牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs)基因启动子的活性;方法:从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5'-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果:本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5'-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论:ggpps基因的5'-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5'-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础.     

Functional Analysis of Nodulin-like Promoter in Transgenic Cotton Plants

For the first time, a nodulin-like gene promoter was isolated from Gossypium hirsutum L. Guo Y18 by means of inverse PCR. Three plant expression vectors were constructed for functional identification of the promoter. These vectors were different only in promoter regions; three truncations of the nodulinlike promoter took the place of the CaMV35S promoter in the pBI121 plant expression vector. Then, the three vectors were introduced into cotton plants via the pollen tube pathway. The expression patterns of the gus gene driven by nodulin-like promoter truncations were investigated in the offspring of transgenic cotton plants. Histochemical GUS staining and fluorescence quantitative analysis were performed to achieve this goal. The results showed that the nodulin-like promoter was a strong, highly reproductive organspecific promoter, which demonstrated a much higher driver activity than the CaMV35S promoter did in cotton reproductive organs, but relatively lower activity in vegetation. Identification of the speciality and strength-determining regions of the nodulin-like promoter was also undertaken.     

伪狂犬病毒gD基因在转基因烟草中的表达

将猪伪狂犬病毒 (pseudorabiesvirus ,PRV)最主要的保护性抗原基因gD完整编码区亚克隆到修饰的植物双元表达载体pBI 35SL中 ,使其置于强启动子CaMV 35S doubleenhancer TEV 5′UTR下游 ,构建的转基因植物双元表达质粒经农杆菌介导转化烟草 .PCR检测叶片筛选阳性植株 ,Southern杂交进一步证实gD已整合到转基因烟草基因组中 .固相酶联斑点试验和Western印迹表明 ,gD在烟草获得正确表达并具有抗原性     

植物双元表达载体pCRI1210的构建及其功能验证

pBI121是转基因研究中的常用载体,但是其多克隆位点相对较少,所携带的GUS基因检测较为复杂。为了增加其多克隆位点,增强其表达效率,简化其检测方法,本研究在pBI121载体的基础上,在其骨架中插入含有CaMV35S启动子、棉花β-tubulin基因内含子和CaMV 35S polyA终止子的干涉表达框,该表达框含有GFP报告基因。通过验证,所插入的干涉表达框能够正常表达插入的外源基因,且GFP基因可以正常表达。该载体被命名为pCRI1210,它是一种双元植物表达载体,既可以用来当作表达载体,又可以用作干涉载体。本研究为转基因研究提供了一种非常实用的工具。     

ggpps 5′-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的：研究栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs）基因启动子的活性;方法：从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5′-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果：本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5′-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论：ggpps基因的5′-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5′-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础。