重组大肠杆菌高效催化合成γ-氨基丁酸

[目的]实现重组大肠杆菌高效合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。[方法]构建表达谷氨酸脱羧酶的基因工程菌Escherichia coli p ET-GAD,对催化工艺进行初步优化,实现高效催化L-谷氨酸脱羧反应合成GABA。[结果]在谷氨酸脱羧酶的表达过程中,维生素B6盐酸吡哆醇(PN)可以替代5-磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶补给,提高工程菌E. coli p ET-GAD的催化活力。在50 m L反应体系中,重组细胞浓度为8 mg/m L,底物浓度为200 mmol/L,在35℃、p H 4. 4条件下反应2 h,L-谷氨酸的转化率 98%。为了提高GABA的生产效率,采用谷氨酸/谷氨酸钠分批补料方式控制反应过程中的p H值,GABA的最终浓度达到247 g/L。[结论]重组大肠杆菌可以高效催化合成γ-氨基丁酸,为基因工程菌工业化制备GABA提供实验依据。     

重组谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的工艺条件优化

谷氨酸脱羧酶,一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶,能专一、不可逆地催化L-谷氨酸脱羧得到γ-氨基丁酸(GABA)。构建了产Lactobacillus brevis WJH3谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-gad,以此作为菌种进行摇瓶发酵诱导培养,发酵过程中一次性添加0.05 mmol/L PLP培养24 h,破壁上清酶活达81.7 U/m L,是不添加PLP对照酶活的1.8倍。对酶转化L-谷氨酸钠生成GABA反应条件进行了优化,结果表明,在转化体系不添加PLP的情况下,底物谷氨酸钠浓度为250 g/L,反应初始p H5.0,温度37℃,加酶量60 U/g底物,转速200 r/min,在此条件下反应18 h,GABA转化率达到100%,为γ-氨基丁酸的工业化生产奠定基础。     

一株产谷氨酸脱羧酶乳酸菌的鉴定及其酶学性质

从28株乳酸菌中筛选到了10株谷氨酸脱羧酶产生菌,其中以菌株Y-2的活性最高,当菌体(湿重)与1%谷氨酸一钠溶液按1∶10混合,于37℃反应12 h,转化液中γ-氨基丁酸浓度为14.52±0.93 mmol/L。通过形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌株Y-2为唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivariussubsp.thermophilus)。同时基于16S rDNA构建了系统进化树,并进行了系统发育分析。S.salivariussubsp.thermophilusY-2谷氨酸脱羧酶的粗酶最适反应温度和pH分别为45℃和5.0,在4~40℃和pH 4.75~5.25范围内较稳定,酶催化反应在0~6 h具有良好的线性。     

豇豆初生叶多胺氧化酶的催化特性

从豇豆幼苗 (6d苗龄 )初生叶提纯得到的多胺氧化酶 (EC 1 .4.3 .6 )属于二胺氧化酶 ,最有效的底物是 1 ,4 二胺丁烷 (腐胺 )、1 ,5 二胺戊烷 (尸胺 )、1 ,6 二胺己烷、1 ,1 0 二胺癸烷等α 二胺 ,其催化活性随二胺类底物碳链的增长而相应减弱。豇豆多胺氧化酶对亚精胺和精胺也具有较高的催化活性。另外 ,底物腐胺和尸胺的浓度超过 2mmol/L或亚精胺和精胺浓度超过 3mmol/L时会对酶活性有抑制效应。以腐胺和尸胺为底物时 ,酶的最适 pH约为7.0 ,而以亚精胺和精胺为底物时其最适pH为 6 .5。该酶的催化活性还随反应介质的离子强度增加而降低。K ,Ca2 和Mg2 (皆为 1 0mmol/L)对酶活性无明显抑制作用 ,而同样浓度的Mn2 ,Zn2 ,Fe2 ,Co2 和Cd2 则对酶活性有不同程度的抑制作用。金属螯合剂EDTA(1 0mmol/L)和腺苷蛋氨酸脱羧酶抑制剂甲基乙二醛 双脒腙 (0 .1mmol/L)可抑制酶活性约 80 % ,而铜结合剂KCN(1 .0mmol/L)、羰基试剂羟胺 (0 .1mmol/L)和氨基胍 (0 .1mmol/L)可导致该酶完全失活     

阿维菌素起始酰基转移酶的底物特异性

[背景]阿维菌素起始酰基转移酶(AveAT0)能够以2-甲基丁酰-辅酶A (coenzyme A,CoA)和异丁酰-CoA作为起始单元分别合成"a"系列或"b"系列的阿维菌素。[目的]探究AveAT0对两种底物的偏好性并进行改造。[方法]通过与识别不同底物的起始酰基转移酶(loading acyltransferases,AT0s)进行序列比对,找到AveAT0底物结合重要的氨基酸,利用活性位点定点突变的方法得到对底物偏好性改变的特定突变体。以2-甲基丁酰-CoA、异丁酰-CoA的类似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨(N-acetylcysteamine,SNAC)和异丁酰-SNAC为底物,用Ellman测试法检测释放SNAC的游离巯基(sulfhydryl,SH),测定AveAT0及其突变体的动力学常数,以此表征AveAT0及其突变体的底物偏好性。[结果]AveAT0对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.4 mmol/L,kcat值为14.1 min^-1,kcat/Km为32.1 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为6.4 min^-1,kcat/Km为7.5 L/(mmol·min)。选定的突变位点为V224M、Q149L、L121M。按顺序累积突变后发现三突变株AveAT0 V224M/Q149L/L121M对两个底物的偏好性区别最大,对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为5.4 min^-1,kcat/Km为6.9 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的kcat/Km为0.1 L/(mmol·min)。[结论]研究发现了AveAT0识别底物过程中的关键氨基酸,为改造阿维菌素聚酮合酶酰基转移酶提供了依据。     

比色法快速测定酶转化反应中γ-氨基丁酸质量分数

建立了谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸过程中产物质量分数快速测定的比色检测方法,其原理为Berthelot显色测定ω-氨基酸的反应。结果表明,该方法灵敏度较高,准确度好,快捷有效,可替代氨基酸分析仪分析法。取不同时段反应液300μL在冰浴中加200μL 0.2 mol.L-1硼酸缓冲液(pH10.0)终止反应,加入体积分数6%重蒸苯酚100μL和质量分数10%次氯酸钠400μL,沸水浴加热10 m in后冰浴冷却5 m in,630 nm测定吸光度值,以标准曲线法确定γ-氨基丁酸的质量分数。该方法适合大批量样品的快速分析,但需排除游离氨的影响。     

面包酵母催化不对称合成4-氯-(R)-3-羟基丁酸乙酯

以4 氯乙酰乙酸乙酯为原料,以面包酵母为手性生物催化剂,选择性合成光学活性4 氯 (R) 3 羟基丁酸乙酯。经IR、GC MS、1HNMR和旋光度测定,表明所得产品的结构与预期的结构一致。分别考察了面包酵母用量、葡萄糖浓度、底物投入量、pH值、反应时间以及反应温度等因素对产品比旋光度的影响。结果表明,4 氯乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的适宜条件为:面包酵母6 0 0g/L、葡萄糖2 0g/L、反应温度34℃、底物加量16mL/L、反应时间4 8h、pH为5 ,产品的比旋光度为[α]2 0D = 13 9°。     

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。     

双酶偶联转化富马酸制备β-丙氨酸的工艺的建立与优化

酶转化法是生产β-丙氨酸的重要途径,但单一酶法转化存在底物价格较高的问题。通过构建双酶催化体系制备β-丙氨酸,即将来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶(AspA)和来源于谷氨酸棒杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸。催化反应中AspA与PanD的最适加酶比例为1∶80,其中AspA的浓度为10μg/mL,转化温度为37℃,pH为7.0;浓度为100 mmol/L的富马酸可在8 h内被完全转化,转化率为100%,摩尔产率为90.9%,β-丙氨酸的产量为90 mmol/L,约为7 g/L;浓度为200 mmol/L的富马酸在反应8 h后,体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol/L,约合9.8 g/L,继续延长反应时间,转化率并没有明显提高。根据该研究提出的双酶偶联转化工艺可将价格低廉的富马酸一步转化为具有高附加值的β-丙氨酸。     

基因工程菌1016氨基酰化酶的酶学性质研究

研究了基因工程菌 1 0 1 6所产的氨基酰化酶的酶学特性。该酶的拆分速率符合米氏方程 ,且在 0 .5mol/L的高底物浓度下 ,无底物抑制现象。 37℃时的米氏常数和最大反应速率分别为 0 .0 4 8mmol/L和 2 .1 78mmol/L·h。最适反应温度为 5 5℃。5 5℃时 ,Km为 0 .0 37mmol/L ,Vmax为 2 .5 5 8mmol/L·h。最适底物为乙酰蛋氨酸 ;热稳定性好。